Способ получения иммобилизованной целлюлозы

(21 22 рен,вская,одионов во СС льс2,74,ш 1 о, Я.Тоигц,войства целиакрилнитрилеля, 1976,см 23 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ Н ДВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬ(56)1. Авторское свидет9 709631, кл. С 077/2, Патент США Р 3929кл. С 07 С 3.7/02, 1975.3, Н, ТаМааЬ 1 О. Б 1Н. Нцш 1 о. Получение и слюлозы, связанной с пололой в качестве носитР 2, 71-76. Г 54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ путем .:овалентногосвязывания целлюлазы с полимернымносителем, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения ферментативной активности получаемого продукта, в качестве полимерного носителя используют хитин, активированныйп-бензохиноном, и процесс ведут привесовом соотношении целлюлазы: носитель 0,06-0,4):1.925108у - ц Рллщлот Активность иммоб люлазы: эндоглюкана глюкозы/мг белка ( ная 0,98 мкйоль гл лизованной целная 9,2 мкмоль 0,9)ф, целлобиа козы/мг белка Изобретение относится к способуполучения иммобилизованных Ферментов,в частности целлюлазы, Иммобилизован"ные ферменты используются в качествебиохимических реактивов, лекарственных препаратов, а также в химической,5микробиологической и пищевой промышленности в качестве гетерогенныхбиокатализаторов,Иммобилизация целлюлазы обеспечивает создание более эффективного гид-,"0ролизующего агента,Известна стабилизация целлюлазыв растворимой Форме (1) и иммобилизация целлюлазы на нерастворимых носителях 2,3",15Практическое использование такихферментов, как целлюлаза и Р -глюкозидаза, входящих в целлюлолитическийкомплекс, требует получения целлюлазы в нератворимой Форме. 20Известен способ получения иммобилизованной целлюлазы путем связывания ее с пенополиуретаном. Однаков результате процесса происходитзначительная инактивация фермента (2, 25Известен также способ полученияиммобилизованной целлюлазы из Аараг 11 аа п.де. путем связывания фермента с полимерным носителем-полиакрилонитрилсмолой. Активность поВ результате высокой реакционно- способности хинонов реакция ковалентного связывания Фермента с носителем проходит быстро и с небольшими потерями Фермента, Продолкительность реакции связывания 1 ч. Связывается до 72 от взятого количества фермента, Это обеспечивает экономию фермента, На данном носителе хорошо иммобилизуются все компоненты целлюлолитического комплекса. ( -1,4-Эндоглюканазы иммобилизуются с сохранением 80,9 от исходной активности (по Ба-КМЦ), (-1,4-глюканцеллобиогидролазы иммобилизуются с сохранением 60 от исходной активности (по целлобиозе).Иммобилизованные 3 -глюкозидазы показывают 37 активности от активности исходных ( -глюкозидаз (по бО п-нитрофенил Д-глюкопиранозиду) .Пр им ер 1, К 2,5 гносителя (с содерканием 280 мкг экв хиноновых групп на 1(г носителя) прибавляют рас твор 1,0 г,целлюлазного препарата в 65 лученной иммобилизованной целлюлаэы составляет 20 от исходной активности фермента 31,Недостатком способа является низкая активность иммобилизованной целлюлазы.Целью изобретения является повышение ферментативной активности иммобилизованной целлюлазы. Цель достигается способом получения иммобилизованной целлюлазы, заключающимся в ковалентном связывании целлюлазы с полимерным носителем, отличительными особенностями которого являются использование в качестве полимерного носителя хитина, активированного п-бензохиноном, и ведение процесса при весовом соотношении целлюлаза : носитель (0,06- .0,4: 1).Хитин, активированный п-бензохиноном, содержит 0,2-0,28 мкг. экв хиноновых групп на 1 г носителя.Электронно-акцепторные карбонильные группы создают недостаток электронов на углеродном кольце, вследствие чего хиноны являются электрсакцепторными соединениями и легко вступают в реакцию с нуклеофильными реагентами. Схема реакции следуощая: 0 1 н. ацетатного буфера (Р" 48Исгользуется целлолазный препарат из гриба Соао+г 1 сИ.н сапа 1 йип с содержанием белка 50 и эндоглюканазной (по Иа-КМП) активностью 11,37 мкмоль глюкозы/мг белка, целлобиазной (по целлобиозе) активностью 1,13 мкмоль глюкозы/мг белка и-глюкозидазной (по п-нитрофенил-(-Б-глюкопиранозиду) активностью 1,16 мкмоль глюкозы/мг белкаВьдерживают при комнатной температуре 1 ч и отфильтровывают. Промывают Зх 15 мл 1 М раствора МаС 1 и 2 х 10 мл ацетатного буфера. Связывается 72 от взятого количества белка. Полученный препарат иммобилизованной целлюлазы содержит 43,6 мг белкана 1 г носителя.925108 Составитель О. СкородумоваТехред М.Тепер Корректор А, Тяско Редактор Бородкина Заказ 1162/6 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4(69,8 Ц,3 -глюкозидазная О,43 мкмольглюкозы/мг белка (36,9),П р и м е р 2. К 1 г носителя при. -бавляют раствор 0,2 г целлюлазногопрепарата иэ ОеоСг 1 сЬпш сапй 1 йпш в3 мл 0,05 н. ацетатного буфера5(рН 4,8) . Выдерживают при комнатнойтемпературе 1 ч и отфильтровывают,Промывают 3 х 10 мл 1 М раствораМаС 1 и 2 х 5 мл ацетатного буфера,Получают препарат иммобилизованнойцеллюлазы с активностью: эндоглюканаэной 9,13 мк.моль глюкозы/мг белка(80,2), целлобиазной 0,68 мкмольглюкозы/мг белка (60,0,),-глюкозидазной 0,42 мкмоль глюкозы/мг белка (37,1).П р и м е р 3. К 2 г носителяприбавляют раствор 0,3 г целлюлазногопрепарата в 4 мл 0,05 н, ацетатногобуфера (рН 4,8) . Используется целлюлазный препарат из гриба Тг 1 споаегща11 дпопш с содержанием белка 40 иэндоглюконазной активностью 32 мкмольглюкозы/мг белка, целлобиазной активностью 3,4 мкмоль глюкозы/мг белка,-глюкозидазной активностью1,9,мкмоль, глюкозы/мг белка,Выдерживают при 4 С в течение20 ч.Отфильтровывают и промывают3 х 15 мл 1 М ИаС 1 и 1 х 10 мл ацетатного буфера. Получают препаратиммобилизованной целлюлазы с содержанием белка 43,2 мг на 1 г носителя. Активность иммобилизоваиной целлюлазы: эндоглюканазная 25,8 мкмоль глюкозы/мг белка (80, 8), целлобиазная 2,0 мкмоль глюкозы/мг белка (601) 3 -глюкозидазная 0,7 мкмоль глюкозы/мг белка (37,0) .Определение активностей целлюлазы:401. Глюканаэная (по На-КМЦ).Активность определяется по количеству редуцирующих сахаров, образующихся при гидролизе 1 мл 1-ного раствора натриевой соли карбоксиметил целлюлозы (14 а-КМЦ) в течение 1 ч при 50 С в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,8 ). Определение редуцирующих сахаров проводят с 3,5-динитросалициловой кислотой. По калибровочнойкривой глюкозы определяют активностьв г глюкозы на 1 мл реакционной смеси и пересчитывают в мкмоль глюкозы на 1 мг связанного белка.2. Целлобиазная (по целлобиоэе) .Активность определяется по количеству редуцирующих сахаров, образующихся при гидролизе 1 мл 0,2-ного раствора целлобиозы в течение0,5 ч при 40 С в 0,25 М ацетатном буФере (рН 4,7), Определение редуцирующих сахаров проводят глюкоэооксидазным методом,3. Арилглюкоэидазная по п-нитрофенил3-глюкопираноэиду) .Активность определяется по количеству п-нитрофенола, образовавшегосяпри гидролизе 1 мл 0,001 М п-нитрофенил - 3 -глюкопиранозида в течение 10 мин при 400 С в 0,1 М ацетатномбуфере (рН 4,7). После колориметрирования (3 Фильтр) по калибровочной кри=вой определяют содержание и-нитрофенола, пересчитывают в мкмоль на1 мг белка,Преимуществами предлагаемого способа являются экономия Ферментногопрепарата и увеличение удельной активности иммобилизованного фермента.Высокие показатели всех активностейиммобилизованнсй целлюлазы являютсяпредпосылкой практического использования иммобилизованного препарата.Иммобилизованная целлобиаэа можетбыть применена для окончательногогидролиза олигосахаридов, получаемыхв процессе ферментативного расщепления целлюлозы ферментами, содержащими недостаточное количество целлобиазы, дс глюкозы.Иммобилизованные 3-глюконазы могутнайти применение для ги,дуолиэа -глюканов,Иммобилизованная Ц -глюкозидаэа может быть использована для Полученияиз-глюкозидов агликонов, которыеприменяются в фармацевтической про-мышленности,