Способ получения стероида

Сфез СоввтеннкСфциалиетичееиинРвепублни ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51)М. Кл. С 12 Р 1/00 А 61 К 37/24 9 ВудаРатмннын квинтет СССР во делан нзабретеннй н аткрытнйОпубликовано 070182, бюллетейь ЛЪДата опубликования описания 0701.82(7) Заявите 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СХЕРОИДА Изобретение относится к медицин" ской промышленности и касается получения лекарственных стероидов.Известен способ получения стероида путем микробиологического гидролиэа эфира стероида с последующим выделением целевого продукта1 1.Однако известный способ обеспечивает незначительный выход целевого продукта (403). Цель изобретения - повышение выхода стероида.Цель достигается тем, что способ получения стероида осуществляют путем микробиологического гидролиза эфира стероида с последующим выделением целевого продукта, а гидролиэ ведут с помощью штаммаАгй)тгоЬасйег сйгецз ИБФМ ВАгй)тгоЬасйег сйгецз ИБФМ ВВгечЬасйегцв 1 цйецв ИБФМ ВВгеч 1 Ьасйегцв сйгецв ИБФМ Вили СогцпеЬасйегцв пздозцв ИБФМ ВМикробиологическую трансформацию проводят любым известным способом (растущей культурой или отмытыми клетками), стероид вносят в органическом растворителе или в микрокристаллическом состоянии.П р и м е р 1. Культуру АгСЬгоЬасйег ссецв ИБФМ Вподдерживают на кукурузно-глюкозном агаре, Х: глюкоза 1; кукурузный экстракт 1; агар- агар 3; водопроводная вода дол; рН 6,8-7,2. Для выращивания микроорганизма используют 750 мл колбы Эрлен- мейра, содержащие 150 мл среды аналогичного состава, но без агар-агара, Для засева с косяков делают смыв 7,5 мл стерильной водопроводной водой. В колбу со 150 мл среды вносят 5,0 мл бактериальной суспензии, содержащей 2,0 г/л клеток, Биомассу измеряют нефелометрически с последующим пересчетом на вес сухой биомассы. Культуру выращивают 24-26 ч на качалке 180 об/мин при 28 фС до содержанияЭ 896070 4биомассы 2-3 г/л, затем вносят сте- туральной жидкости показывают, чтороид - 21-ацетат кортизона (300 мг)содержание гидролизованного стероида,в этанольном растворе (1 О мл). кортизона, составляет 953.Конечная концентрация стероида со- Аналогичным образом используют дпяставляет 2 г/л. Через 48 ч трансфор гидролиза ацетата кортизона (2 г/л)мации процесс заканчивается. Резуль- растущие клетки следующих штаммов.таты хроматографического анализа куль- Результаты анализов приведены в;табл,.Т а б л и ц а 1 Штамм Количество гидролизованного стероида (через 24 ч трансформации),7. АгййгоЬасйег с 11 гецз В Вге 1 Ьас 1 ег 1 цв с 1 йгецв В Вгеч 1 Ьасйег 1 цп 1 цСецш ВСогупеЬасйег 1 цщ 1 пз 101 озца В 98 98 95 95 П р и м е р 2. Культуру АгЬгоЬас 1 ег с 1 йгецз Ввыращивают аналогично примеру 1. 25 После выращивания клетки отделяютцентрифугированием при 6000, 20 мин,ресуспендируют в стерильной водопроводной воде до необходимой концентра- ЗОции (8 г/л) и используют для трансформации,Трансформацию осуществляют в условиях, аналогичных выращиванию, в750 мл колбах Эрленмейра, содержащих150 мл реакционной смеси, Микрокристаллический стероид - 21-ацетат кортизона (величина частиц 5-ЗОЯ) вносят ,до конечной концентрации 100 г/л.Через 10-12 сут трансформации заканчи Овается, культуральную жидкость отфильтровывают на воронке со стеклянным пористым дном (фильтр В 1) с однимбумажным и двумя полотняными фильтрами. Осадок с фильтра переносят в колбу и кипятят 30 мин с 30-кратным избытком изопропанола. Операцию повторяют трижды, декантируя раствор и добавляя новую порцию растворителя.Объединенный изопропанольный раствор50кортизона обрабатывают 0,3 г активированного угля при комнатной температуре (20 ч). Уголь отфильтровываютс помощью стеклянного пористого фильтра 9 4 и фильтрат упаривают до объема 10-15 мл. Концентрированный раст 55вор охлаждают и выдерживают 20 ч при0 С, Осадок (кортизон) отфильтровыбвают, промывают охлажденным изопропаиолом и сушат в вакуум-эксикаторе до постоянного веса.Из 4,85 г ацетата кортизона получают 3,6 г кортизона (82,0 Х от теоретического). Т. пл. 219-2216 Еф1 См = 450 (в метаноле). Примесь ацетата кортизона составляет 13 и 20 1 э-оксипроизводного кортизона - следовые количества.Из маточного раствора путем экстракции этилацетатом и последующей перекристаллизации сырого продукта из изопропанола дополнительно выделяют 0,15 г кортизона с Т. пл, 214-25 С, Е " = 430 (в метаноле), Общий выход1 смкортизона составляет 85,53 от теоретического количества.П р и м е р 3. Выращивают культуру АгйЬгоЬасег с 1 Сгецз ИБФИ В"51 аналогично примеру 1. Дпя трансформации используют клетки, отделенны . от среды, ресуспендированные в водопроводной воде, в количестве 3 г/л. Стероид, микрокристаллический 21-аце" тат преднизона (величина частиц 5- 30,ц ) вносят в концентрации 10 г/л. Трансформацию осуществляют в услоиях, аналогичных выращиванию.Через 48 ч трансформации культуральную жидкость (общий объем 200 мл: ;100 мл ферментативной смеси+100 мл дистиллированной воды для смыва) экстрагируют этилацетатом 4 раза по 200 мл. Раствор экстрагируют этилацетатом 4 раза по 200 мп. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и упаривают при 20 С на роторном испарителе89 6070 Ьвыход преднизона 0,72 г (85 Х от теоретического количества),Кроме ацетата кортизона и ацетатапреднизона культура АгСЬоЬасйег с 1 й 5 гецэ ИБФМ Восуществляет трансформацию других эфиров стероидов(табл. 2). В условиях выращивания,описанных в примере 2, для трансформации используют отмытые клетки приф биомассе 2 г/л и концентрации стерои. да 1 г/л. Как следует иэ данных хроматографического анализа выход продуктов трансформации составляет 95-1003.Результаты гидролиза различных1 з эфиров стероидов культурой АгФгоЬасйег с 1 йгецз ИБФМ(по данныи хроматографического анализа система бензол-ацетон 3:1, силуфол й,) приведены в табл 2Эф Т а б л и ц а 2 до объема 5-7 мл. Конце.трированныйраствор преднизона охлаждают и выдерживают 20 ч при 0 С, промывают охлажденным иэопропанолом, сушат в вакуумэксикаторе до постоянного веса. Из0,95 г ацетата преднизона получают0,70 г преднизона (827 от теоретическог количества), Т. пл. 224-220 С,Е,с 440 (в метаноле). Примесь ацетата преднизона составляет 1 Х и 20 1 З-оксипроизводного преднизона - следы. Иэ маточного раствора путем экстракции этилацетатом и перекристаллизации сырого продукта из изопропанола дополнительно выделяют 0,02 г . преднизона с Т. пл . 220-222 С. Общий Количество гидролизованного стероида Е, через,Субстрат,3-ацетат дегидрозпиандростеронаЗЬ-ацетат 1 Ы.-дегидропрег- ненолона 50 100 50 100 Предложенный способ позволяет уве- ния выхода стероида, гидролиз ведутличить выход стероира с 40 Ж известным с помощью штаммаспособом до 80-983. Аг 1 ЬгоЬасйег с 1 йгецз ИБФМ В,АгйЬгоЬасег с 1 йгецз ИБФМ В,ВгеТЬасйег 1 ца 1 цйеца ИБФМ В,Формула изобретенияВгеч 1 Ьасйег 1 ца с 1 йгеца ИБФМ В илиСпособ получения стероида путем, СогупеЬасйег 1 ца 1 пз 141 озца ИБФМ В.микробиологического гидролиэа эфира Источники информации,стероида с последующим выделением принятые во внимание при экспертизе5целевого продукта, о т л и ч а ю - 1. Патент США У 2908696,щ и й с я тем, что, с целью повыше- .кл. 260-397, 45, 1968.ВНИИПИ Заказ 11631/10 Тираж 504 ПодписноеФилиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектна, 4