Способ получения поверхностногоантигена гепатита b

1 эа 62 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Соеетских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 07.04.81 1) М. Кл,зА 61 К 39/2 1 осударстееиный комитет СССР йо делам изобретений и открытий(71) Заявите Цент Знам льный ор и научно на Ленин сследоват и перелив НИЯ ПОВЕРХЫОСГЕПАТИТАВ ГО АНТИ.Гк;И 4) СПОСОБ йОЛ Изобретение отн цины и касается п диагностических исИзвестен способ го антигена гепат плазмы крови соля осадка, обработки полиэтиленгликоле лением целевого и осадка и его очис вания в градиенте диализа 11.Однако известнь ет высокой стабил та в процессе хран ным соединением форма д д е-леицина.Способ осузом.5 Плазму крови, выбракованную по иммунологическому тесту на НВ,-антиген, с титром 1: 2 - 1: 8 и выше (по данным метода ВИЭОФ), отделяют от форменных элементов крови при 1500 об/мин в течение 30 мин.В случае использования замороженной плазмы ее размораживают и центрифугируют при 8000 об/мин для удаления выпав.ших нитей фибрина.Для перевода плазмы в сыворотку ее на гревают на водяной бане до 37 фС и добавляют тромбин или 2,7-ный раствор хлористого кальция. Тромбин прибавляют из расчета 1 ед, активности - 1 мл плазмы.2,7%-ный раствор хлористого кальция сме шивают с плазмой при соотношении 9:1,т. е. на 9 частей плазмы - 1 часть хлористого кальция.После образования сгустка фибрина егоотделяют фильтрованием. К полученной 25 сыворотке добавляют 0,5 н. раствор соляной кислоты до рН 4,5, Выпавший осадой удаляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 -20 мин. В последующей работе используют супернатант. К 0 нему при активном перемешивании вносят 1 О й способ не обеспечиваьности целевого продукения. Целью истабильносхраненияЭта цельный послеосадок эксэкстрактгель-хроманию, отбиргают их улфугированел днализаграфин, подиализуют осится к области медиолучения препаратов для следований.получения поверхностноита В путем обработки ной кислотой, отделения надосадочной жидкости м с последующим выдеродукта из полученного ткой путем концентрироплотности сахарозь 1 и бретения является повышение целевого продукта в процессе достигается тем, что получен- обработки полиэтиленгликолем трагируют хлористым натрием, диализуют, затем подвергают тографическому фракционироваают активные фракции, подверьтрафильтрации, ультрацентриию в хлористом цезии, затем посподвергают афинной хроматолученный элюат концентрируют, и обрабатывают аминометилольМ. Власихина, А. М, ПА. Семини ордена Трудового Крльский институт гематания крови ществляют следующим обра.1:256 450 -ный раствор полиэтиленгликоля (ПЗГ) с молекулярной массой 6000 до конечной концентрации 5%Осадок формируется в течение 4 - 5 час при комнатной температуре. Возможно дгльнейщее формировадддде осадка в течение 18 час гри 4 1. Выпавший осадок отделяюд ",еддтрддф, ированием при 1 ООЫО обмин в течение 20 - 30 мин. С.упернатаит не содержит НВ,-аитигена (по дан. и:.дд ме,.зда 551:1,.)Ф 1 и представлен альоу;.пнодд по Данддьддмето;12 электОО 05 О 11222нна а.,ета;нои пленке 1.ПО п;О 11111 1 Осааок тосхко 21110 3.,стозди ",лют Б д),121 д д;естьо.,е хлористого ,ари 51 в ходддсй О.в;и 5 тки -1 стракцдддо проводят на мп;н дой мешалке в течение 12 час 12 и" следУ додд.;над центР ич 1 Угдд Роз а н нем и Р 1 8000 - 10 О(10 ОЬ/ми 1 в течение 15 - 20 мЯ 11.11 осле трехкратной экстракцпи осадок з дальн;йшедд не используют, с.сли экстракци 10 не прОизводят, то Осадок устойчив к хранению при 4"С с сохранением активности НВ,-антигена в течение 1 - 2 месяцев.Подготовленный экстракт диализуют против 0,15 М раствора хлористого натрия в течение 24 - 48 час при 4"С, Диализованный экстракт подвергают гель-хроматографии через сефадекс 6-200. Используют колонку для хроматографии размером 5,0 К Х 60,0 см, предварительно заполненную гелем и эквилибрированную 0,15 М раствором хлористого натрия, Гель-хроматография направлена на получение первого макроглобулярного пика, Фракциивходящие в этот ник, объединяют и концентрируют, используя ультрафильтрацию, При проведении. ультрафильтрации целесообразно одновременно подверга.дь препарат проточному диализу 0,15 М раствором хлористого натрия.По окончании ультрафильтрации раствор белка наносят на преформированный стуенчатый градиент хлористого цезия от 1,1 до 1,4 г/см. Ультрацентрифугирование проводят при 25000 об/мин в течение 18 час. Фракции после ультрацентрифугирования разделяют на автоматическом коллекторе и объединяют по наличию в них НВ,-анти- гена в максимальных активностях. ОбъедиХарактеристика препарата 15 25 30 :35 40 45 50 4ненные фракцидд диализуют против 0,15 М раствора хлористого натрия прп 4"С и концЕНтрИруЮт ультрафи.дЬдрац 151 й11 олученный препарат наносят иа линейный градиент плотности сахаро ы От 1 О до 20 ее и подвеРгают УльтРгцентРвРУгиРованию при 2 ОООО оодмидд в гечеддие 115 час. 11 о окончании цеддтрисругированддя срракции, содержащие НЫ;-антигедд, объединяют и диализуат против 0,1 Л 1 Трпс.1.-1 С буфера рН 7,.2 в течение 448 ч:; при 4 С.(иализовапный препарат подверают афсиной хрома".Ографии через носительсоде)жаши 11 Рь О 1 сОактивные антитела и белк 25 И крови ЧЕЛОВЕК 2, ЭЛЮат ПОСЛЕ 2115 И 1111 сйД ХООМИТО- г 12 С:ии концентрируют ультрафддльтрацд:.сй и,51 длизудот против 0,15 М раствора:.пористого натрия.К полученному препарату поверхд-;остддого аддтигена гепатита В в соотнощении 1: . добавляют раствор, содеожащий 0,132 И е-лейцина и О,ООбб М формальдегдда. Для приготовления 100 мл раствора гминометилольного соединения формальдегида и е-лейцина необходимо приготовить и смедпать 50 мл раствора е-лейцина, добавив 1,73 г в-лейцина и 5 О мл формальдегида из расчета: 0,1 мл 11,3 М раствора на 85,5 мл физиологического раствора.В случае радиоактивной метки НВ,-анти- гена для подготовки аминометилольного соединения формальдегида используют радиоактивный формальдегид по С", д.,уммарная активность препарата может быть в пре. делах от 0,1 мк до 100 мк и более.Полученную смесь белка и аминометилольисго соединения формальдегида и е-лейцина выдерживают при 22 - 37 С в течение 72 час, после чего препарат может храниться при 4 С в течение одного года (срок наблюдения) без изменения активности НВ,-антигена с сохранением стерильности раствора,Для удаления непрореагировавшего аминометилольного соединения препарат подвергают гель-фильтрации через сефадекс 11-50 или ультрафильтрации с проточным диализом.В таблице приведены результаты, подтверждающие стабильные свойства препарата при хранении.818621 Составитель С. Малютина Техред А. Камышникова Корректор Р, Беркович Редактор О. Иванова Заказ 741 18 Изд. Лг 283 Тираж 694 ПодписноеНПО Поиск с осударственного комитета СССР по делам изобрегений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 Препарат, обработаццый аминометцлоль- НЫМ СОО 1 ЦНСЦНСМ фОРгпаЛЬ 1 ЕГИДа . Е-ЛЕйННЗ, СГр,цяССЧ.,уцг ГСНН С . Впйг тВЗ Вце звнсцмостц от споссбз ввсдсция, цо стцонснно н,нвгц 1 у белку, не пс.1 вергн;смУс и чо.сификапци( особ позв ляет выделять препарат цо. ссрнгст;ого знтиген; гепатита В ис сырья, с.ссркзщссс низкие и высокие титры НВ,. ан гисна1 рензрзт стзбилсц прц хранении и позволяет хранить его в условиях бьстового холодильннкз 4-С) без изменения его антигсннсх и иммуцогецных свойств ц исклюцаст несбхо.симссть хранения препарата пр. нэких температурах ( - 20, - 40, - 196 С), требующих специального оборудования и э.сргоресурсов.Использование в качестве сырья для получения препарата поверхностного антигеца гепатцта В выбраксванной крови, со. держащей НВ-знтигец, позвсляет экономить в год от 50 до 100 тыс руб. Форчулз сзобретсция Способ цслучеия цовс рхно, тного антигена гепатита В путембработки плазмы крови соляной кислотой, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости полиэтилецгликгчем с последующим выделением целевого про 1 укта из полученного осад.5 кз и его с чисткой путеч концентрированияв градиенте плотности сахаровы и днализа, о т л и ч з ю щ и й с я тем, что, с целью повыщеция стзби,ьности целевого продукта в процессе хранения, полученный после об работки полиэти енгликолем осадок экстрагнруют хлористым натрием, экстракт диа.нзуют, затем подвергают гель-хроматографическому фракционированию, отбирают активные фракции, подвергают цх ультра.15 фильтрации, ультрацентрифугированию вв хлористом цезии, затем после лиализа подвергают зфинцой хроматографии, полученный элюат концентрируют, диализуют и обрабатывают аминометилольным соединс нием формальдегпда и в-лейцина. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе25 1. Методические рекомендации Исследование крови доноров на антиген гепатита В, утвер кд МсЗ СССР 11.07.74 г.