Способ получения вируса гепатитаа

щ 81081 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯТОРКОМУ ВДЕТЕЛвСУ Союз Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 07.03.81(5) М Кл 3С 12 К 7/00 Гасударственные комите СССР пе делан изобретений. С. Балаян, А. Г. Анджапаридзе и Е. А. Тольнститут полиомиелита и вирусных энцефали вАМН СССР1 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА АТИТА А ируса гелий больИзобретение относится к медицинской вирусологии.Известен способ получения впатита А путем экстракции феканых гепатитом А 1 Ц,Однако известный способ не позволяет получить вирус в количестве, достаточном для приготовления вакцин, и используется только для диагностики заболевании, при этом частота обнаружения вируса гепатита А в фекалиях больных составляет 8 - 15%.Целью изобретения является повышение выхода вируса.Эта цель достигается тем, что полученным фекальным экстрактом заражают предварительно обработанные трипсином в концентрации 15 - 60 мкг/мл культуры кле. ток перевиваемых клеточных линий Не 1 а и ПЭО, культивируют в среде с тем жс содержанием трипсина, а затем пасспруют в той же среде с дополнительным введением фекального экстракта, не содержащего вирус гепатита А, в конечной концентрации 33 - 50%Способ осуществляют следующим обраПриготавливают фекальный экстракт, ля этого берут 5 г фекалий больного, соержащих вирус гепатита А, добавляют 20,0 мл 0,1 М раствора фосфатно-солевото буфера (ФСБ), вносят несколько стеклянных бус, и смесь встряхивают в течение 15 мин на шуттсль-аппарате, после чего ее 5 заморажпвают - оттаивают трехкратно при- 70 С/+37 С. Затем смесь центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость отделяют и оставляют при 4 С. К осадку добавляют 0,0 мл 10 0,1 М раствора ФСБ и процедуру обработки повторяют еще один раз. Полученную надосадочную жидкость собирают и сливают с первой надосадочной жидкостью.Объединснньш материал вновь центрифу гируют в течение 30 мин при 10000 об/мини собирают надосадочную жидкость. После этого производят обработку фреоном: добавляют 2 объема фреонана 1 объем жидкости, встряхивают в течение 1 ч на шуттель-аппарате, центрифугируют в течение 30 мин прп 3 000 об/мин, собира.ют надосадочную жидкость и измеряют ее объем. Далее впруссодержащпй материал концентрируют путем осаждения полиэти лснгликолсм (ПЭГ) с молекулярным весом6000, для чего берут 1/10 весовую часть сухого ПЭГ (по отношению к весу жидкости), растворяют его полностью в данной жидкости и оставляют на ночь при з 0 4 С. Утром раствор центрифугируют в те 81081155 3чспие 30 мин при 10000 об/мин и осадок рссуспендируют в дистиллированной воде, содержащей антибиотик канамицип в кон. цснтрацпп 0,5- - 1,0 мг/мл. Объем дистиллированной воды составляет 1/5 от объема исходной виру ссодсркащс кпдкос. 11 олучсппьй в результате такой процедуры материал используют для зараксия клеток. Параллельно готовят очищенный и концентрированный экстракт из фекалий, не содержащих вирус гепатита А,Культуры клеток Неа и ПЭО выращивают в среде Игла без сыворотки в пробирках (1,5 Х 15 см). Заражение культур производят через 18- - 24 ч после псресева клеток: удаляют культуральную жидкость и добавляют концентрированный и очищен ный фекальный экстракт, содержащий вирус гепатита А, из расчета 0,1 мл экстракта на 250000 - 500000 клеток, После контакта в течение 1 ч при 37 С в какдуо пробирку с культурой вносят по 1,0 - 2,0 мл среды Игла, содержащей трппсин в концентрации 15 - 60 мкг/мл. Пробирочные культуры инкубируют в течение 18 - 48 ч при 37 С. Последующие пассажи также проводят в пробирочных культурах со средой Игла, содержащей трипсин в тех жс концентрациях, но с добавлением экстракта нормальных (не содержащих вирус гепатита А) фекалий в конечной концентрации 3,3 - 5,0%.Для обнаружения вируса гепатита А используют метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Стандартную сыворотку, в которой было установлено наличие антител к вирусу гепатита А, разводят фи. зиологическим раствором 1:40 - 1;1000 (в зависимости от ее титра). После этого 0,2 мл разведенной сыворотки смешиваюг с 0,8 мл вируссодержащей жидкости (фе. кальпый экстракт, культуральпая жидкость, гомогенат клеток и т, п.). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и затем ночь при 4 С. Утро:смесь цснтрифугируют в течение 2 ч при 15 000 об/мин, осадок ресуспендируют в нескольких каплях дистиллированной воды и смешивают с равным объемом 2 драст.вора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 6,8), взятой в качестве контрастирующего вещества. Через 30 с смесь наносят на спсцпальныс сеточки для электронной микроскопии. Объекты просматривают в электронном микроскопе при увслпчснии 50 000- -100 000.При просмотре в электронном микроскопс препаратов культуральной жпдкост и гомогепата клеток нз зараженных вируссодеряащим материалом культур Неа и ПЭО обнаруживают скопления характерных частиц вируса гепатита Л диаметром 27 пм, покрытых венчиком антител,При просмотре аналогичных препаратов из незараженных культур пли культур, в 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 которые вносили материал, нс содержащийвирус гспатита А, скопления вирусных частиц не наблюдагот.Уровснь продукции вируса гепатита Лв культурах клеток ориентировочно оцени.вают путем сопоставления количества образовавшихся частиц этого вируса с количеством частиц пол иовируса 1 типа(бляшкообразующих) единиц вируса Махони, то это количество соответствует5 10 вирусных частиц, обнаруживаемыхэлектронномикроскопически, оно же соответствует 6000 - 8000 частиц, аггрсгированных антителами и выявляемых методомИЭМ в пяти ячейках сетки. При исходнойконцентрации вируса Махони 5 10,5 10 и т. д. инфекционных единиц в1,0 мл оно составляет соответственно5 10, 5 10, 5 10 и т. д, Физическихвирусных частиц и 4 000 - 6 000, 2 000 -3 000, 1000 - 2000 аггрегированных антителами вирусных частиц в пяти ячейках сетки при иммуноэлектронной микроскопии.Обратный пересчет позволяет на основанииизвестного количества вирусных частиц,определяемых методом ИЭМ, ориентировочно судить о концентрации вирусных частиц в исходном препарате.Для такой оценки продукции вируса гепатита А в клеточных культурах этот вирус, тактике как полиовирус 1 типа Махони,выращивают в культурах Не 1 а. Далее определяют количество образовавшихся вирусных частиц, выявляемых методом ИЭМв ячейках сетки. Вирус Махони до иссле.дования в ИЭМ титруют в культуре ткании определяют количество физических частиц, соответствующих каядому данномуразведению 10, 10-, 10-, 10-. После этого каждое разведение исследуют на содержание вирусных частиц методом ИЭМ. Сопоставляют результаты ИЭМ, полученныес вирусом гепатита А и с вирусом Махопи, после чего выбирают то разведениевируса Махони, в котором количество частиц этого вируса наиболсс близко к коли.чсству частиц вируса гепатита А.При выращивании вируса гепатита А вклеточных культурах содсркапис частицэто о вируса в культуральныхчсрсз 12 - 20 ч после заражения, установленное с помощью описанного выше способа, составляет от 1 10 до 5 10 вирусных частиц в 1,0 мл, Предлагаемый способпозволяет повыснгь выход вируса,Формула изобрстсппяСпособ получения вируса гепатита А путем экстракпии фекалий больных гепатитом А, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода вируса, получен810811 Составитель С. МалютинаТехред А. Камышникова Редактор Г, Петрова Корректор О. Тюрина Заказ 2146 Изд,234 Тираж 530 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома 5ным фекальным экстрактом заражают предварительно обработанные трипсином в концентрации 15 - 60 мкг/мл культуры клеток перевиваемых клеточных линий Не 1 а и ПЭО, культивируют в среде с тем же содержанием трипсина, а затем пассируют в той же средс с дополнительным введением фекального экстракта, нс содержатце 6го вирус гепатита А, в конечной концентрации З,З - 5 Оо/оИсточники информации,принятые во внимание при экспертизе5 1. Я. М. Те 1 пйопе апд а 1 а 1, 1 Эе 1 ес 11 оп1 зу 1 п 1 п 1 цпе е 1 ес 1 гоп ппсгозсору о 1 а лгцз -111 е ап 11 деп аззос 1 а 1 ес 1 Мй асиле 11 пезз,Яс 1 епсе, чо 1. 182, р. 1026 - 1028, 111 З.