Способ радиоиммунологического определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита в.

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ ССССАНИЕ ИЗОБРЕТЕН 39710 АЗ б 011% ЗЗ(71) Хозрасчетное опытное предприятие "Радиопрепарат" Института ядерной физви АН УЗССР(73) Цеголев Александр Семенович(64) СПОСОБ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГООПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ПОВЕРХНОСТНОМУ АНТИГЕНУ ВИРУСА ГЕПАТИТА В.(67) Использование: иммунологические методыанализа вирусных антигенов, в частности диагностика гепатита В человека, Сущность изобретее 1 я:на твердой фазе адсорбируют поверхностный антиген вируса гепатита В /НОАК/, затем инкубируют контрольные и опытные образцы при перемешивании с частотой 300 - 350 об/мин и амплитуде 3 - 4 см в течение 2 - 2,5 ч. После удаления несвязавшихся компонентов и отмывания твердой фазы в реакционную смесь добавляют меченыйНВБАд,- 125 инкубируют при перемешивании в указанных выше условиях в течение 1 - 15 ч, удаляют несвязавшиеся компоненты, отмывают твердую фазу и подсчитывают остаточную радиоактивность. Способ позволяет повысить чувствительность аналогичных методов анализа и сократить время их осуществления.3 табл.Изобретение относится к биотехнологии, медицинской вирусологии и иммунохимии и может быть использовано в медицинской практике, а также в лабораторной научноисследовательской работе,Известен способ определения, который заключается во внесении в полиэтиленовые пробирки с иммобилизованным на внутренней поверхности поверхностным антигеном вируса гепатита В (НВзАд) контрольных(содержащих и не содержащих анти-НВв) и исследуемых образцов инкубации их в течение 12-16 ч при температуре 18-25 ОС, отмывании, второй инкубации с меченным радионуклидом 1-НВэАд в течение 4-6 ч, отмывании и последующем определении остаточной радиоактивности в пробирках.Основной недостаток способа заключается в длительности проведения анализа (16-22 ч).Целью изобретения является сокращение времени проведения анализа при повышении чувствительности тест-системы.Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1, Извлекают флаконы с положительными. и отрицательными контрольными образцами анти-НВз и пробирки из коробки, выдерживают 30-40 мин при температуре 18-25 С. За это время пробирки нумеруют; на положительный контрольный образец 3 пробирки (1-3), на отрицательный контрольный образец 7 пробирок (4 - 10). Вставляют пробирки в штатив, вскрывают Флаконы. В пронумерованные пробирки вносят с помощью пипетки реактивы: в пробирки 1-3 - положительный контрольный образец анти-НВз по 0,1 мл, в пробирки 4 - 10 - отрицательный контрольный образец анти-НВз по 0,1 мл. Закрывают пробирки полиэтиленовой пленкой, которую закрепляют тонким резиновым кольцом, Инкубацию проводят при перемешивании на Э/атег Ьай эЬаМег туре 357 с частотой 350 оборотов в минуту и амплитудой 4 см в течение двух часов при температуре 18-25 ОС, Удаляют содержимое пробирок с помощью водоструйного насоса с ловушкой для сбора жидкости, промывают пробирки дистиллированной водой порциями по 1,5 мл, операцию промывки повторяют трижды, тщательно удаляя воду из пробирок с помощью водоструйного насоса с ловушкой для сбора жидкости после каждой промывки, Извлекают флаконы с 1-НВзАд из ко 125робки и выдерживают в течение 30-40 мин при температуре 18-25 С, Вскрывают их ивносят в каждую пробирку по 0,1 мл реактива "1-НВзАд. Закрывает пробирки поли этиленовой пленкой, которую фиксируюттонким резиновым кольцом,Инкубацию проводят при перемешивании на ЧЧатег ЬатЬ зЬаег туге 357 с частотой350 оборотов в минуту и амплитудой 4 см втечение 1 ч при 18-25 С,Содержимое пробирок удаляют с помощью водоструйного насоса с ловушкойдля сбора жидкости и промывают дистилли 10 рованной водой порциями по 1,5 мл шестьраз, тщательно удаляя воду из пробирок спомощью водоструйного насоса с ловушкойдля сбора жидкости.Измеряют активностьв каждой про 15 бирке с помощью гамма-счетчика эа 1 мин,Для этого сначала определяют фон счетчика по формуле С 1 + С 2 + Сз + С 4 + С 520 йф5240 + 236 + 244 + 221 + 263 - 240 85 30 й 1+ й 2+ йз 3 19786 + 19638 + 19076 240 8 = 3= 19259,2.35 Вычисляют среднее значение (В) количества зарегистрированных счетчиком импульсов при измерении активности отрицательных образцов в пробирках 4 - 10 (й 4, 40 й 5, йб, й 7, й 8, й 9, й 1 о) по формуле В Й 4 + 85 +Йб +Й 7 + Й 8 + М 9 + М 10 7 342 + 359 + 378 + 321 + 354 + 361 + 349Определяют значение отношения А/В по формуле50 АВ А 19259,2 173 5В111Отношение А/В - это показатель качества набора реактивов,.отражающий качество тест-системы и диапазона его из мерений, а также запас прочности набора,Отношение А(В - характеристика,аналогичная соотношению сигнала к шуму, применяемому в электронике и радиотехнике. Вычисляют среднее значение (А) коли чества зарегистрированных счетчикомимпульсов при измерении активности положительных контрольных образцов в пробирках 1 - 3 (й 1, й 2, йз) по ФормулеЗдесь А - сигнал при избыточной концентрации в положительном образце, В - уровень неспецифической фоновой активности,Параллельно провбдят анализ согласно 5 инструкции по применению набора реактивов для радиоиммунологического анализа антител к поверхностному антигену гепатита В с использованием радионуклида 12(РИА-анти-НВз- ), Результаты, получен 125ные при проведении анализа в таком режиме, дают значение отношения А/В, равное 10 149. Таким образом, увеличение отношения А/В в предлагаемом способе по сравнению с прототипом говорит об увеличении 15 качества работы тест-системы и запаса П р и м в р 2. Извлекают флаконы с положительными и отрицательными контрольными образцами анти-НВз и пробирки из коробки, выдерживают 30-40 мин при 18-25 С. Пробирки нумеруют (1-3) - для положительного контрольного образца,(4-10) - для отрицательного контрольного образца, (11-42) - для исследуемых образцов, устанавливают пробирки в штатив. Вскрывают флаконы. Готовят разведения 30 положительного контрольного образца в 1000,2000,4000,8000, 16000,32000, 128000,256000 раз.В пронумерованные пробирки с помощью пипетки вносят реактивы: в пробирки 1-3 - положительный контрольный образец, в пробирки 4-10 - отрицательный контрольный образец, в пробирки 11-12 - положительный контрольный образец, разведенный в 1000 раэ, 13 - 14 - ".азввденный в 2000 раз и т.д. по две пробирки на каждое разведение по 0,1 мл.Закрывают пробирки полиэтиленовой пленкой, которую закрепляют тонким резиновым кольцом. Далее анализ проводят следуя примеру 1 до стадии определения значения отношения А/В.Определяют нижнюю границу положительных результатов по Формуле 40 45 50 й 2,1 В+ чф, 2.1 х 111+ 240,8 473,9 Параллельно проводят анализ с аналогичными разведениями положительного контрольного образца согласно инструкции по применению набора реактивов для радиоиммунологического анализа антител к поверхностному антигену гепатита В с использованием радионуклида 12 (РИА-анпрочности набора реактивов. При этом значительно уменьшается время на проведение анализа, 20 ти-НВз- ), обработка полученных рвзуль.125татов была проведена согласно этой инстРукцииСравнение полученных результатовприведено в табл, 1.Из данных табл, 1 следует, что предлагаемый способ позволяет увеличигь чувствительность тест-системы в 2-4 раза посравнению с прототипом.П р и м е р 3. Анализ осуществляют, какописано выше, при этом первую инкубациюпроводят на ЧЧатег Ьас 1 з 1 аМег туре 357 сразличными значениями частоты, амплитуды ивремени инкубации, Вторую инкубацию проводят согласно прототипу;Полученные результаты представлены втабл, 2, сравнение проводят по отношениюзначений А/В.Таким образом, значения частоты перемешивания 300-350 обмин, амплитуды 3-4см и времени первой инкубации 2-2,5 ч позволяет достигнуть максимального значения отношения А/В, которое являетсякритерием выбора как качественный показатель,П р и м е р 4. Анализ проводят, какописано выше, до стадии второй инкубации.Вторую инкубацию проводят на И/атег Ьас 131 аКег туре 357 с различными значениямичастоты, амплитуды и времени инкубации,Полученные результаты представлены втабл. 3, сравнение проводят по отношениюзначений А/В,Таким образом, значения частоты перемешивания 300-350 об/мин, амплитуды3-4 см и времени второй инкубации 1-1,5 чпозволяют достигнуть максимального значения отношения А/В, которое являетсякритерием выбора как качественный показатель.Итак, использование перемешиванияпри проведении первой инкубации контрольных и исследуемых образцов позволяетсократить время инкубации до 2-2,5 ч вместо 12-16 по прототипу, а использованиеперемешивания при проведении второйинкубации с меченным 125 поверхностным антигеномзируса гепатита В сократиловремя инкубации до 1-1,5 ч (по прототипу4-6 ч); При этом чувствительность тест-системы увеличилась в 2-4 раза по сравнениюс прототипом.(56) Инструкция по применению набора реактивов для радиоиммунологического анализа антител к поверхностному антигену вируса гепатита В с использованием рационуклида(РИА-АНТИ-НВ з). Уз НИИНТИ, Ташкент, 1990.0,5 400 350 300 250 антигеном вируса гепатита В, удаление не- связавшихся компонентов, омывание твердой фазы и. регистрацию остаточной радиоактивности, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения антител и повышения чувствительности способа, первую инкубацию проводят при перемешивании с частотой 300 - 350 об,/мин и амплитуде 3 - 4 см в течение 2- 2,5 ч, а вторую инкубацию проводят при перемешивании в аналогичных условиях в течение 1-1,5 ч. ф о р мул а и зоб рете н ия СПОСОБ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ПОВЕРХНОСТНОМУ АНТИГЕНУ ВИРУСА ГЕПАТИТА В, предусматривающий первую инкубацию контрольных и исследуемых образцов с иммобилизованным на твен.ой фазе поверхностным антигеном вируса гепатита В, удаление несвязавшихся компонентов и отмывание твердой фазы, вторую инкубацию с меченым 1 поверхностным Составитель Е, КалугинТехред М.Моргентал Корректор М, Максимишинец Редактор С, Кулакова Заказ 3413 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4 Л Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул.Гагарина, 101 1 2 3 5 6 1 23 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 54 76 117 115 69 37 63 84 139 140 .69 51 64 89 145 145 71 65 43 71 84 87 57 15 59 83 152 155 75 40 78 97 178 180 89 63 77 93 184 185 97 79 47 77 90 92 62 21 67 88 167 164 79 47 80 100 186 183 91 76 81 96 187 189 106 84 52 81 96 98 68 27 73 91 170 177 82 58 83 103 188 186 97 81 82 101 191 193 114 91 64 84 100 103 75 34 75 92 174 180 85 61 85 102 190 189 100 89 86 103 194 195 116 92 67 88 112 117 77 37 77 92 180 183 83 67 91 106 191 192 102 91 90 100 195 194 119 91 67 93 116 121 83 45 80 94 179 182 87 70 93 110 190 190 101 90 94 102 195 197 125 97 69 90 120 120 83 49 87 98 183 178 90 77 92 109 189 192 104 91 95 105 198 200 120 100 68 95 122 126 86 56