Способ получения препарата терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка

(53) 577.15.07(088.8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРпю делАм изОБРетений и ОтнРытий К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Щ.ЕПАРАТА ТЕРМИНАЛЬНОЙ ДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДИЛТРАНСФЕРАЗЬ 1 ИЗ ТИМУСА ТЕЛЕНКАпутем экстракции ферментаиз измельченного сырья К-фосфатным буфером, отделения экстракта, хроматографирования его на целлюлозномсорбенте.с десорбцией фермента К-Фосфатным буфером рН 7,20,05 с последующим пропусканием полученного десорбируемого раствора через диэтиламиноэтилцеллюлозу, о т л и -, ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества препарата, в качестве целлюлозного сорбента используют аминоэтилцеллюлозу с иммобилизованной,. на" ней дезоксирибонуклеийовой кислотой в количестве 45"70 мг/г сорбента.2. Способ по п.1, о т л"и ч а ющ и й с я тем, что в качестве экстрагирующего К-фосфатного буфера используют Кфосфатный буфер рН 7,41 1 д .+0,05.:Расход Фосфоцеллюлозы на проведение 1 цикла выделения 6-8 г, 40смола используется в 3-4 циклах.Недостатками способа являютсяиспользование фосфоцеллюлозы Р для сорбции ДНТФазы из гомогенататимуса. После 3-4 регенераций емкость Фосфоцеллюлозы Рпадает в2 раза, что делает ее непригоднойдля дальнейшего использования впроцессе выделения ДНТФазы. Процессрегенерации Фосфоцеллюлозы длителен,он включает промывки Фосфоцеллюлоэы 0,15 н.НС 1 в 50-ном этаноле, во-дой, 0 15 н, На 0 Н с 0 005 4 ЭДТАи вновь водой. Регенерацию ведут в.течеиие 2-5 сут в зависимости от55количества Фосфоцеллюлозы,Проведение рехроматографииДНГФазы на Фосфоцеллюлозе Рявляется длительным процессом - нанесение раствора ДНТФазы на колонкус Рведут в течение 20-40 ч, 60Препарат, полученный данным способом, содержит помимо целевогофермента, примесь Фосфодиэстеразы(фермента, разрушающего олиго- иполинуклеотиды) .После иммобилизации 65 Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения препарата фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазю (ДНТФазы) из тимуса теленка и может быть использовано для анализа на содержание фермента ДНТФазы .в клеточных экстрактах животных тканей. Получаемый препарат после его иммобилйзации может быть использован в процессах получения олиго- и полидезоксинуклеотидов.Известен сп 6 соб получения препарата терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераэы из тимуса теленка, состоящий из следующих стадий:1,Экстракция Фермента из предварительно измельченного сырья К-ФосФатным буфером, рН которого обычно 7,4+0,05, отделение экстракта от остатков сырья.2. Хроматографирование. экстракта на Фосфоцеллюлозе Рс десорбцией фермента К-фосфатным буфером рН 7,2+0,05 у3, Пропускание десорбируемого . раствора, содержащего фермент, че. рез диэтиламиноэтилцеллюлоэу для удаления нуклеиновых кислот;4. Рехроматография раствора, полученного на предыдущей стадии, на Фосфоцеллюлозе Р(длительность 20-40 ч);5, Концентрирование дезоксинуклеотидилтрансфераэы обработкой раствора (нн 4)280 в количестве 55%2т степени насыщения, перераствореие полученного осадка в К-.фосфатом буфере рН 7,2.101520253035 препарата, полученного на стадии5, получают препараты иммобилизованной ДНТФазы, содержащие до0,5 ед.акт/мг ФДЭ. Использованиетаких препаратов иммобилизованнойДНТФазы в синтезе дезокснполимеровзатруднено ввиду высокого содержания фосфодиэстеразы,Цель изобретения - упрощениепроцесса получения препарата ДНТФазы,пригодного для использованияв синтезе полидезоксинуклеотидови улучшение качества препарата засчет снижения содержания фосфодиэстеразы в препарате,Это достигается описываемым способом получения препарата ДНТФазы изтимуса теленка, который заключаешьсяв экстракции фермента из измельченного сырья К.-фосфатным буфером(обычно имеющим рН 7,4+0,05), отделении экстракта, хроматографировании его на целлюлоэном .сорбенте -аминоэтилцеллюлозе с иммобилизованной на ней дезоксирибонуклеиновойкислотой в количестве 45-70 мг/гсорбента с десорбцией фермента К-Фосфатным буфером рН 7,2+0,05 с последующим пропусканием получаемогодесорбируемого раствора через диэтиламиноэтилцеллюлозу.Отличительным признаком данногоизобретения является использованиев качестве целлюлозного сорбента прихроматографии экстракта аминоэтилцеллюлозы с иммобилиэованной на нейдезоксирибонуклеиновой кислотой" вколичестве 45-70 мг/г сорбента(ДНК-АЭ-целлюлозы), способ получения которой описан,Таким образом, описываемый способпозволяет сократить длительностьпроцесса за счет сокращения числастадий до трех.В результате проведения этих трехстадий выделения ДНТФазы получаютпрепарат фермента с .удельной активностью но включению дезоксиденозиинтрифосфата 1000-1500 ед/мг,т.е, такой же, как после 5 стадийспособа, - прототипа. Кроме того,этот препарат не содержит дажеследов,фосфодиэстераэы - Фермента, разрушающего полинуклеотиды,Выход ДНТФаэы составляет 14000 -18000 ед.акт, из.100 г тимуса.Расход ДНК-АЭ-целлюлозы на проведение 1 цикла выделения ДНТФазыиз 100 г тимуса составляет 12-20 г,сорбент может быть использован какминимум в 9 циклах. Как показалиопыты по многократному использованию ДНК-АЭ-целлюлозы для выделения ДНТФазы из гомогената тимуса,хроматографические свойства ДНК-АЭ-целлюлозы не ухудшились в результате проведения 9 циклов выделения:выход и удельная активность препарасухого веса) с содержанием ДНК.50 мг/г сорбента и перемешивают смесь механической мешалкой в течение 1 ч,ДНТфазу объединяют и измеряют в них вешенную 0,2 М К-фосфатом рН 7,2 сцелью удаления нуклеиновых кислотиз раствора ДНТФаэы. Пропускают через колонку еще 4 мл 0,2 М К-Фосфатного буфера. рН 7,2, элюат собираюти объединяют с раствором Фермента.В элюате измеряют оптическую плотность при 280 нм и 260 нм, активность ДНТфаэы и Фосфодиэстеразы. эстераза по-прежнему полностью отсутствует, удельная активность ДНТфазы позволяет. упростить процесс полу 5 Тираж 522 Подписное,;,г.ужгород,ул.Проектная,тов ДНТФазы в 1 и 9 опытах билиодинаковыми, примеси фосфодиэстеразыв йрепаратах отсутствовали полностью, Во всех случаях происходила не допуская вспенивания смеси, Заколичественная сорбция ДНТФазы и тем дают смоле отстояться в течениегомогената тимуса дНК-АЭ- целлюлозой, 5 30 мин, верхний слой супернатанта,Это было установлено и контрольны- не содержащий частиц сорбента, деми опытами, в которых супернатанты кантируют и сливают в канализацию.после стадии 2 выделения ДНТФазы Сметанообразную суспензию смолы влина ДНК-АЭ- целлюлозе подвергали об- вают в колонку, нижний кран колонкиработке Фосфоцеллюлозой Р, 10 открывают и дают стечь жидкости доПроцесс регенерации ДНК-АЭ- целлю уровня смолы в колонке. Сорбент в колонкелозы также менее трудоемок, чем промывают 3-4 объемами 0,05 М К-фосфатарегенерация Фосфоцеллюлозы Р. рН 7,2 до оптической плотности в элюатеРегенерация сорбента ДНК-АЭ-цел- при 260 нм 0,29 об.ед./мл,после чеголюлоэы заключается в обработке его 15 промывку прекращают.1 М 0,1 М БаСХ путем перемешивания ДНТФаэу элюируют с ДНК-ЭА-целлюмеханической мешалкой 1 ч. сорбента лозы 0,2 М К-фосфатом рН 7,2, Собис 5 ч. 1 М+0,1 М БаС 1, которое повто- рают фракции по 6 мл и измеряют вряют 3-4 раза, и водой, Процесс них активность ДНТфаэы по включениюрегенерации длится 5-10 ч в зависи йАМФ-С ф в кислотонерастворимый промости от количества сорбента. дукт с олигонуклеотидами в качествеПрепарат ДНТфазы, полученный на инициатора. Фракции, содержащие3-ей стадии очистки, иммобилиэуютна сефарозе, активированной ВгСН, оптическую плотность ДвоД 6 оактивПрепараты иммобилизованной ДНТФазы 25 ность ДНТфаэы и фосфодиэстеразы, Выне содержат даже следов Фосфодиэсте- ход по активности ДНТФазы составразы и пригодны для получения поли- ляет на этой стадии 15300 ед.акт.иэдезоксинуклеотидов, 100 г тимуса (эа 1 ед.акт. принимают.При оценке активности за единицу ак- такое количество фермента, которое, тивности ДНТФаэы принимали такое коли- каталиэирует включение 1 нм аАМФ в,".чество фермента, которое включает в кис- кислотонерастворимую фракцию эа 1"члотонерастворимый продукт 1 нмдезокси- при 37 С), Фосфодиэстераза во Фрак-.аденозинтрифосфата(МАТФ)за 1 ч ярк 37 С. циях, содержащих ДНТфазу, не обнаЗа единицу активности Фосфоди- ружена при инкубации с субстратом в теэстераэы принимали такое количество чение 13 ч.В качестве субстрата испольфермента, которое гидролизует 1 нм З 5 зовали и-нитрофениловый эфир тимидина.,субстрата (паранитрофенилтимидилата) 45 мл элюата, содержащего ДНТФ.за 1 ч при 37 С,оазу, пропускают через колонку сП р и вл е р,(Все операции проводят ДЭАЭ-целлюлозой объемом 9 мл уравнооРпри 2-5 С). 120 г тимуса, очищенного от пленок и жира, режут на кусочки 5-10 см,. гомогенизируют их.вмясорубке. 100 г полученной измельченной массы помещают в стеклянныйстакан, приливают 400 мл буфера, содержащего 0,04 2 Я НаС 1; 0,008 М КН, РОл 450,03 4 М К ЬРО , рН 7,4,и перемешйва-ют смесь механической мешалкой втечение 1 ч, не допуская.-вспенива" После проведения этой стадии выходния смеси. Смесь центрифугируют в ДНТФазы остается прежним, фосфодитечение 1 ч при 12000 об/мин в цент.рифуге ЮВесХвап в роторе Ю.Нерастворимый осадок отбрасывают, по включению аАТФ 1270 ед.акт./мг.супернатант помещают в стеклянный Использование описываемого спостакан и доводят рН до 6,5, добав- соба получения препарата ДНТфавы. ляя 10-ную СНЗСООН по каплям, припостоянном перемешивании механичес- чения препарата дНТфазы за счеткой мешалкой, рН раствора измеряют сокращения числа стадий процесса;"при помощи рН-метра. Смесь оставляют на повысить качество препарата заночь во льду, затем центрифугируют, не-:, счет удаления примесей фосфодиэсрастворимый осадок отбрасывают. тераэы на первой стадии; заменитьСупернатант, полученный при цент фосфоцеллюлоэу Рфирмы МЬасааприфугировании (объем 400 мл) поме- более стабильным сорбентом, не трещают в стакан и вливают в него 90 мл бующим длительной регенерации растпастообразной ДНК-АЭ-целлюлозы (18 г ворами кислот и щелочей.ВНИИПИ Заказ 1138/филиал ППП "Патент",