Способ получения полипептида

Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет - (32) 11. 11. 76 С 07 С 103/52//А 61 К 37/02 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения ИностранцыСумпеи Сакакибара, Таданори Морикава и Ясуо Накагава (Япония) Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА Изобретение относится к способу получения нового полипептида-аналога кальцитонина, биологически активного соединения, которое может найти применение в медицине. В пептидной химии широко известны способы образования пептидной связи, например карбодиимидный 11, также широко используют для отщепления защитных групп фтористый водород 1.21.Цель изобретения - получение новых соединений, обладающих ценными фармакологическими свойствами.Поставленная цель достигается описываемым способом получения полипептида Формулы (Ц .-СерВзЕ-тр-ВзЕ 1-ННСНС 0- в,Мет-Лей-Гли-ОН . 30 конденсируют с соединением формулы (111)Н-тр- ВзЕ -тир- ВзС в (Сйт )-тр-ВзЕ -Глн-Асп-ОвзГ-Фе-Асн-Лиз-СРСб-Фе-Гис-Тр-Взс-Фе-Про-Глн-Тр-ВзГ -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-ЙНс последующим отщеплением защитныхгрупп от полученного лродукта конденсации. В указанных формулах приняты следующие сокращения:Вос-трет-бутоксикарбонилСбз-бензилоксикарбонилВзВ -бензилВзЕ(СВ )-дихлорбензилОЕс-этиловый сложный эфирОвзС -бензиловый сложный эфирСер.-серикЛейлейцинВал.-валинАрг.-аргининАла.-аланинЛиз - -лизинГлюглютаминовая кислотаТиртироэинФе.-фенилаланинТФК-трифторуксусная кислотаЦГА-циклогексиламинТГФ-тетрагидрофуран(СН )5 чение р-Тр-ННСНС н-Асп-Фен-Т -Ала-И Лей слотыв кМ 52с н(СН ет-Лей-Гл еси ДМФ ираствору АсОЕ-этилацетатИ 5 С-й-этил-й -диметиламинопропилкарбодиимидГСИ-й-оксисукцинимидМеОН-метанолАсОН-уксусная кислотаГМФА"гексаметилфосфортриамид5АОС-трет-амилоксикарбонилСГСбз-о-хлорбензилоксикарбонилТоз-тозилОви-трет-бутиловый сложный эфирОНР-и-нитрофениловый сложный эфир 10050-М-оксисукцинилимидный сложныйэфирАсн-С-аспарагинТр-С-треонинПро-С"пролин 1Асп-С-аспарагиновая кислотаГли-глицинГлн-С-глютаминГисгистидинМет-С-метионин 20Иле-С-изолейцинТозОН-п-толуолсульфокислотаДЦГА-дициклогексиламинДМФ-диметилформамидДЦК-дициклогексилкарбодиимидОБТ-оксибензотриазолЕВОН-этанолБуОН-бутанолАминокислотный анализ,Образец гидролизуют 6 н, солянойкислотой (с добавлением нескольких , 30окапель анизола) при 110 С в течение45 ч и сушат при пониженном давлении,аминокислотному О Гли Асн-Лей-Се 0-Мет-Гли-Тр-Тир-Тр-Гл Асн-Лиз-Фе-Гис-Тр-Фе-Про-Гл р ле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-йН 2.2,0 г (0,6 моль) ВОС-Тр-Вз 1 -Тир-/Вз СС ) -ТР-Взй-Глн-Асп-Взй -Фе-Асн-Лиз-С 6 Сбз-Фе-Гис-Тр-Вз-Фе-Про-Глн-Тр-Вз 1 -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МН растворяют в 10 мл ТГФ при -5 С. Раствор перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и концентрируют в вакууме, продукт осаждают этилацетатом. Осадок отделяют, сушат над гидроокисью натрия. Сухой осадок растворяют в 10 мп ДМФ и устанавливают рН 9 путем добавления триэтилами на при охлаждении. К раствору прибавляют воду до образования осадка. Осадок отделяют, сушат над Р 20 для получения ВОС соединения в виде свободного основания.0,8 г(0,71 моль) ей-Сер-Вз -Тр-ВзС -ННСНС -ОН растворяют в 5 мл Н-метилпирролидона (1:1 рибавляют 122 мг 050,а затем при охлаждении 146 мг ДЦК, растворенного в 3 мл ДМФ, и перемешивают в течение ночи. Выпавший осадок удаляют и к маточнику прибавляют ВОС-свободное основание, полученное выше, и прибавляют 100 мг ОБТ, потом смесь перемешивают 5 дней прио30 С. К реакционной смеси прибавляют воду. Отфильтровывают образовавшийся при этом осадок, промывают водой, затем сушат, получают 2,6 г-Мет-Лей-Гли-Тр-Взй -Тир-ВзЕ ( СР) - -Тр-ВзС -Глн-Асн-ОВз 1-Фе- Асн-Лиз-С 8 Сбз-Фе-Гис-Тр-Вз -Фе-Про-Глн-ТрВз 1 -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-йН в качестве сырого продукта.1,0 г этого продукта обрабатываю 25 мл фтористого водорода, 0,1 г метионина и 2 мл анизола при -5 С в течение 60 мин при охлаждении смесью сухого льда и метанола при пониженном давлении в присутствии диметилтиоэфира. После отгонки фтористого водорода остаток промывают диэтиловым эфиром и собирают декантацией. Процедуру повторяют три раза,и осадок растворяют в смешанном раст воре 30 мл уксусной кислоты и 10 мл воды. Затем раствор пропускают через колонку с Дауэкс (1) ацетатная фор ма (2,58 см), промывают 200 мл воды и снова пропускают элюат через колонку НР(2,57 см). 80-ный этанольный раствор пропускают через колонку и после удаления из элюата зта нола раствор лиофилизируют, получают 440 мг порошка, Раствор 440 мг порош ка в 0,01 М водном ацетате аммония вносят в колонку, наполненную СМ-цел люлозой (2,225 см) и продукт элюируют с линейным градиентом элюирования 0,01-0,2 1 М ацетатом аммония (каждый - 750 мл), рН,5. Собирают фракции по 10 мл и активные фракции (фракции РР 67-70) объединяют и сушат вымораживанием для полу чения активного порошка. Лиофилизат растворяют в 1 М уксусной кислоте и хроматографируют на колонке с Сефадексом 1.Н=20 (2,2 137 м), элюируя продукт 1 М АсОН. Собирают фракции по 6 мл, активные фракции (РР 28-37) лиофилизируют.Лиофилизат растворяют в верхнем е смеси бутанола, уксусной кисло- и воды (4:1:5) и загружают раство олонку с Сефадексом 6-25 (2,7см), который был упакован вместеижним слоем указанной выше смеси растворителей и после этого помещен в верхний слой указанной смеси растворителей, Элюирование проводят тем же верхним слоем, активные фракции (трубки 5-14) собирают и лиофилизируютПолученный порошок повторно793385 хроматографируют в тех же условияхна Сефадексе Си лиофнлизируют.Лиофилизированный активный порошокрастворяют в 1 М уксусной кислоте,выливают в колонку с Сефадексом 1.Н(2,2137 см), элюируют 1 М уксуснойкислотой, собирают фракции по 5 г.Активные фракции объединяют и лиофилиэируют для получения 29,7 мг продукта (1000 МРС (мг). т-.Лейизе-Гли"-Лей-С Взй -Тр-ВэЕ - Нй С Н С Р= 0,43/носите проявитель:н-бутано та-вода (верхний слЫ) р: -69,6 (с:0 кислота). Млоза, 1слоМерк целл уксусная )4:1:5/.2, 1 М ук н точники инфор о внимание пр ер Э., Любке "Мир", 1967, же, стр. 112,ации,эксперти Пептид 116.приняты1. Ш ч. 1, М2. Т Составитель В. Волковаедактор Н. Потапова Техред М.Рейвес Корректор С. Шекма 5арственн зобретенЖ, Р Заказ 9635/ Подписноеомитета СССРоткрытийая наб., д. 4 Тираж 49НИИПИ Госудпо делам и35, Москва,г йилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Амино Гис 1,01 Сер 1,06 Гли 4,00 Мет 0,87 Тир 0,96 ковая ки ислотныи а 1), Асп 2, 1), Глю 2, 4), Ала 2, 1), Иле О, 1),фе 3,18 лота 1,02( 20,15 (1)0 (5),96 (2),95 (1),84 (2), 2нопробализ; Лиз 4(3),Тр 4, 4(2),Про 1 0(2),Вал 0 6(1),Лей 1 3),-ами ). формула изобретения Способ получения полипептида фор-мулыСН 2 , н Лей-Сер-Тр-НМСНСО-М ир-Тр-Глн-Асп-Фе-Аснр-фе-Про-Глн-Тр-Ала-И Ала-Про-НН, а ю щ и й с я т е формулы (11)(СНу ),-Мет-Лей-Глй-ОНконденсируют с соединением формулы (111)Н-Тр-Вэб -Тир- ВзЮ(СЙ )3 -Тр-ВэЕ -Глн -Асп-ОВэГ-Фе-Асн-Лиз-СВСбз-Фе-Гис-Тр-Вз 0 -Фе-Про-Глн-Тр-ВзР -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-НН 2с последующим отщеплением защитных групп от полученного продукта конденсации.Ис м