Способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде

и и А-н йи.в ЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оев Советскнк оциалистичесннв Республик(22) Заявлено 1206.78 (21) 2629673/28 вием заявки Мо 25749/1 рисоедин 3) ПриориОпубли Государственный комитет СССР по дедам изобретений и открытийет -овано 070 ллетень ЙЯ 25 576.8093 ,1(088.8) бликования оп та ания 07.07,8 72) Авторы изобретени Г. Сучко А ова Ростовский-на-Дону государственный научноисследовательский противочумный институт явитель(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕН НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЬ В ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ иво 0-215ультуогокие приз аки озрач" ко ка шт шт или итриты в нит ижает Изобретение относится к медицине а именно микробиологии,Известен способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде путем внес ния в нее тест-культуры с последующим инкубированием и определением количества никотиновой кислоты помутности среды1.Однако известный способ обладает недостаточно высокой точностью.Целью изобретения является повышение точности способа.Эта цель достигается тем, что вчестве тест-культуры используют амм Сегвиа реьсь 1300 Мс амм Сегиа реьь ЕЧ 28/8 Мс.Никотинадмидзависимый мутант С.ревав 1300-215 Мс получен иэ вирулентного штамма 1300 после воздействия нитроэометилмочевиной из числа вариантов, устойчивых к налид ксовой кислоте.Мутант 1300-215 Мс обладает ста бильно высокой избирательной реакцией на никотиновую кислоту.Штамм Сегвиа реьсь 1300-215 М .депонирован в коллекции Всесоюзного ордена Трудового Красного, Знамени научно-исследовательского прчумного института "Микроб".Штамм Сегоиа ревсс 130характеризуется следующимино-морфологическими и фиэиолбиохимическими признаками.Культурально-морфологичес Полиморфные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 1-2 мкм в длину и 0,3-0,5 мкм в ширину. Жгутиков не имеет, спор не образует, Бульон Хоттингера.Хлопьевидный осадок, бульон пр ный, Агар Хоттингера. Образует лонии сероватого цвета диаметром 0,5-2 мм с приподнятым зернистым центром и фестончатой периферической зоной.,Физиолого-биохимические признаки.Оптимум роста 26-28 СФерментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабиноэу, галактоэу, маннозу.1 Восстанавливаетраты.Желатину не раз Индол не образу 305 Сероводород выделяет,Продуцирует пестицин 1,Среда Джексона-Берроуза с гемином,Образует непигментированные колонйи.Требует для роста наличия в питательной среде лейцина, метионина,Фенилаланина, тресгнина, цистеина иникотиновой кислоты или никотинамида.Вирулентные свойства.Авирулентен для белых мышей приподкожном введении от 10 до 10 фмикробных клеток и для морских свинок до 10 микробных клеток.Никотинамидэависимый мутантС, реьсз ЕЧ 28/8 И 3.с получен извакцинного штамма ЕЧ после воздействия нитрозометилмочевиной иэчисла вариантов, устойчивых к налидиксовой кйслоте.Мутант 28/8 йс обладает стабильно высокой избирательной реакциейна никотиновую кислоту. 20Штамм Дега 3 иа реей 3 а 28/8 й сдепонирован в коллекции Всесоюзногоордена Трудового Красного Знаменинаучно-исследовательского института"Микроб". 25Штамм Оегвпа реясь 28/8 Й 1 схарактеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологобиохимическими признаками.Культурально-морфологические признаки.Полиморфные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 1-2 мкм в длину и 0,3-0,5 мкмв ширину. Жгутиков не имеет, спор необразует.Бульон Хоттингера. Хлопьевидныйосадок, бульон прозрачный. Агар Хоттингера. Образует колонии сероватого цвета диаметром 0,5-2 мм с приподнятым зернистым центром и фестончатой периферической зоной.физиолого-биохимические признаки.Оптимум роста 2 бС.ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, 45маннит, арабинозу, галактоэу, маннозу.Восстанавливает нитриты в нитраты.Желатину не разжижает. 50Индол не образует.Сероводород выделяет.Продуцирует пестицин 1.Среда Джексона-Берроуза с гемином.Образует непигментированные колонны.Требует для роста наличия в питательной среде лейцина; метионина,Фенилаланина, треонина, цистеина иникотиновой кислоты или никотинамкда,Вирулентные свойства.Авирулентен для белых мышей при 40подкожном введении от 10 до 108микробных клеток и для морских сви-,нок до 10 о микробных клеток.П р и м е р. В качестве основнойсреды используется синтетическая среца на фосфатном буфере М/15 рН 7,17,2. Непосредственно перед опытомвносят стерильно в 100 мл основыследующие компоненты; 0,5 мл 20-ногораствора (МН 4) 504, 0,25 мл 10-ногоМАЗО 7 НО, 0,5 мл 40-ной глюкозы,раствор сульфита натрия до концентрации 0,1 и аминокислоты (лейцин,метионин, треонин, фенилаФанин ицистеин) и дозах 0,01 мг/мл. Готовят два параллельных ряда пробирокс последовательными десятикратнымиразведениями исследуемой питательной среды, Разводят до 10 э основнойсинтетической средой без добавленияникотиновой кислоты,Для построения стандартной кривой роста тест-штамма также два параллельных ряда пробирок заполняютпо 4,5 мл основной синтетической среды с добавлением никотиновой кислоты, в количествах 10" 10 1 10-а1 Р 110 , 10 , 10 мкг/мл. Затем в каждуюпробирку как в опытном, так и в стандартных рядах, вносят по 0,5 млистощенной суспенэии тест-штамма,создавая посевную концентрацию200 млн. мк./мл. Посевы помещают втермостат при 28 С.После выдерживания посевов в течение суток производят ежедневное определение интенсивности роста тест-штамма путем измерения мутности среды с помощью нефелометра. По достижении максимальных показаний прибора и появлении тенденции к снижению опыт прекращают.С целью снятия показаний нефелометра непосредственно с пробирок, выпиливают специальные черные эбонитовые вкладыши с окнами для светового пучка, которые позволяют в течение длительного времени наблюдать посевы в жидких средах,не нарушая их стерильности.Стандартную кривую вычерчиваютна основе средних показаний из двухопределений мутности в нефелометредля каждой точки стандартного раствора витамина. На оси абсцисс откладывают десятйчные логарифмы кднцентраций витамина, на оси ординатнаносят средние значения показанийприбора. Соединяя точки пересечения,получают стандартную кривую, характеризующую ответную реакцию тесткультуры в зависимости от концентрации никотиновой кислоты в среде.Пользуясь ею путем экстраполирования определяют содержание витамина вмиллилитре испытуемого раствора длякаждой точки.Использование изобретения позволяет определить никотиновую кислотув пределах до 10 фмкг/мл, что на порядок превосходит чувствительностьизвестного способа,745941 Составитель Е, ДубовицкаяРедактор С, Тараненко Техред, М. Петко Корректор Е Папп Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5формула изобретенияСпособ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде путем внесения в нее тест-культуры с последующим ин-. кубированием и определением количества никотиновой кислоты по мутности среды, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве тест-культуры используют штамм бегп 1 а реьс 1 с 1300-215 Мс или Сегопе реьс 1 з ЕЧ 28/8 й 1 с.Источники информации,5 принятые во внимание при экспертизе1. Одинцова Е.И. Микробиологические методы определения витаминов.