Способ выращивания

О П И Е Союз СоветскииСоциалистическихРеспублик 11745942 ИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М. Кл. С 12 К 1/00 Гооударстееииый комитет СССР ио делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Грозненское научно-производственное объединение Промавтоматика(54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ВАС 11.ШЯ ТНИК 1 Иб 1 ЕХ 313 ЧАР. 6 А 1.1.ЕК 1 АЕИзобретение относится к области микробиологического синтеза с использованием продуцентов, обладающих способностью ко вторичному метаболизму, в результате которого получаются токсины, и может быть использовано в микробиологической промыш-ленности.Известно, что вирулентность некоторых энтомопатогенных препаратов, в частности энтобоктерина, связана с токсинообразованием продуцента 1.При выращивании микроорганизмов, синв тезирующих инсектицидные токсины, большое значение имеет регулирование метаболических механизмов, которое для получения максимальных выходов продуктов может быть связано с нарушением роста клетки или ее метаболизма, При этом условия, важные для получения максимальной массы клеток, обычно не совпадают с теми, которые обеспечивают максимальный выход продукта метаболизма-токсина. 20В частности известно, что состав питательной среды, а также соотношение различных компонентов питательной среды влияет на выработку токсинов микроорганизмами 21. 2Однако каких-либо конкретных соотношений различных компонентов питательнойсреды, влияющих на биосинтез токсинов, визвестных выше источниках не приведено.Наиболее распространенными компонентами, используемыми в промышленных производствах, являются кукурузный экстракт,кормовые дрожжи, рыбная мука - как источник азотистых веществ, и глюкоза, крахмал,кукурузная мука - как источник и углеводов.Выбор количественных соотношений иконцентраций этих компонентов направленна получение максимального выхода продуктов вторичного метаболизма - токсинов,Известен промышленный способ выращивания аэробных токсинаобразующих энтомопатогенных микроорганизмов Вас. йиг 1 препз 1 з наг. даПег 1 ае на жидкой питательной среде, содержащей сахара (700900 мг% в пересчете на глюкозу) и аминокислоты (45-75 мг% аминного азота) на1 л среды, причем питательная среда такогосостава стиммулирует усовия спорогенеза икристаообразования в микроорганизмах засчет лимитизации процесса по сахараМ Я.В результате спорообразования и кристаллообразования формируется лнсектицидность препарата. По окончании ферментации среда оказывается истощенной по сахарам (содержание сахаров составляет 50 мг% в пересчете на глюкозу), но она содержит значительные количества аминокислот (содержание аминного азота составляет 30- 60 мг%).Недостатком этого способа выращивания микроорганизмов является низкая токсичность получаемого препарата и нецелесообразный расход дорогостоящего сырья, содержащего аминокислоты.Целью изобретения является увеличение активности получаемого энтобактерина при одновременном сокращении затрат на его получение: сокращаются затраты на сырье, содержащее аминокислоты при производстве инсектицидных препаратов с использованием Вас. Вцг 1 препз 1 з чаг да 11 ег 1 ае. Указанная цель достигается тем, что выращивание этого микроорганизма проводят в условиях лимитизации среды по азоту, а также тем, что микроорганизмы выращивают на питательной среде, содержащей углеводов 700-1200 мг% (в пересчете на глюкозу) и 15 - 30 мг% аминного азота на 1 л среды.Лимитизацию среды по азоту можно достигнуть различными путями: уменьшением в исходной питательной среде содержания компонента, являющегося источником амино кислот при периодических пересевах; дробной подачей или поддержанием определенного лимитирующего уровня азота в периодических лелевых процессах. При этом механизм метаболизма, регулирующий синтез токсинов, переключается на увеличение выхода вторичных метаболитов - токсинов.В приведенную ниже таблицу сведены результаты лабораторной проверки предлагаемого способа в сопоставлении с прототипом, показывающие увеличение степени токсичности (уменьшение летальной концентрации культуральной жидкости для биологического тест-объекта) при условиях лимитации процесса поаминному азоту.Проверка проводилась на способе периддического культивирования продуцента Вас 111 цз 1 Ьцг 1 препз 1 з на питательных средах различного состава.Токсичность оценивалась по тест-объекту гусениц Вас.да 11 ег 1 ае гпе 1 апе 1 а. Как видно из приведенных в таблицеданных, культурная жидкость, получаемаяна средах, объединенных по аминному азоту, имеет токсичность в 3-5 раз выше, чемна средах, стимулирующих лимитацию процесса по сахарам. Причем по известному способу имеется избыток аминного азота в конце ферментации, а по предлагаемому способу к концу ферментации аминный азот исчерпан до нуля.Пример 1. Питательная среда, содержащая кукурузный экстракт (15 мг% аминного азота) и глюкозу (700 мг% глюкозы), приготовленная на водопроводной воде, имела рН среды 7,3 ед; была простерилизована при 0,7 ати 20 мин и разлита в колбы по 40 мл. Засев производили водной суспензией спор культуры Вас. 1 Ьцг 1 препМз чаг, да 11 ег 1 ае штамм69/6. Колбы помещались на круговую качалку с чйслом оборотов 350 мин при 30 С.Процесс выращивания продолжался30 час. В конце ферментации при спорообразовании на 90% титр спор составлял около 2-109/мл культуральной жидкости. Токсичность культуральной жидкости, выраженная в Лк ьо, определяемая по ТУ 59-61-74 производства энтобактрина, составляла 0,9%Пример 2. Выращивание Вас. 1 Ьцг 1 пфепз 1 з проводили в условиях, аналогичных приведенным в примере 1, на питательной среде, содержащей кормовые дрожжи (25 мг% аминного азота) и кукурузную муку зЕ (800 мг% глюкозы) . Титр и токсичность культуральной жидкости составляли соответственно 1,8109/мл и Лкьо - 0,7%.Осуществление предлагаемого способапозволит при меньших затратах увеличить токсичность получаемой культуральной жидкости в 3-5 раз и токсичность получаемых на ее основе сухого или жидкого препаратов, При принятом в настоящее время эталоне токсичности, например в производстве энтобактерина, увеличение токсичности поев лучаемой культуральной жидкости при сохранении того же уровня производительности аппаратов (ферментаторов) позволит увеличить выход готового препарата за счет боьшего разбавления его наполнителем.Одновременно при этом снижается расход дорогостоящего сырья, содержащего аминокислоты, например кукурузного экстракта в 4,8 раза, а кормовых дрожжей в 3 раза, что означает снижение себестоимости готовой продукции только за счет этой зф статьи расходов (затраты на сырье) на 25%.745942 Результаты лабораторной проверки предлагаемогоспособа по сравнению со способом-прототипом Состав исходнойпитательной среды Состав культурной среды в конце ферментации Характер питательной среды содержание аминсодержание глюсодер- жание содержание глюного азо та, мг% аминнокозы, мг% козы,мг% та го азота, мг% 1, Кукурузныйэкстракт, глюкозаа) по известному способу 2,5 50 72 700 4,8 б) по предлага- емому 700 0,9 0,0 150 2, Кормовые дрожжи глюкоза а) по известному способу60 3,7 80 800 2,4 6) по предлага- емому 0,7 0,0 800 25 200 1200 мг/, (в пересчете на глюкозу) и 15 -м 30 мг% аминного азота на 1 л среды.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Фрейман В. Б. и др. Труды ВНИИбакпрепарат, Антибиотики в борьбе с болезнями сельскохозяйственных культур. Бактериальные энтомопатогенные препараты. М.,1973, вып. 2, с. 74,2. Микроорганизмы в борьбе с вредителями, насекомыми и клещами. М., Колос,1976, с. 413-415.3. Промышленный регламент92. Бердский химический завод. 1974 - прототип. Формула изобретения ЦНИИПИ Заказ 3895/18 Тираж 522 Подписное Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 1. Способ выращивания Вас 111 пз Фцг 1 препз 18 чаг. даПепае на жидкой питательной среде с лимитизацией одного из компонентов среды, отличающийся тем, что, .с целью увеличения активности получаемого при выращивании энтобактерина и сокращения затрат на получение последнего, выращивание микроорганизма проводят в условиях лимитизации среды по азоту.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что микроорганизм вырашивают на питательной среде, содержащее углеводов 700 ЛетательВо скольная конценко раз трация кульсократилтуральнойся расжидкости,Л 50 %ного азо