Стабилизированный состав для определения мочевины, содержащий уреазу

(131) Р 26 12 726, 4 (33) ФРГОпубликовано 25,06,8 а Бюллетень Ж 23Дата опубликования описания 2506.80 Сфефз Сфветскнх Сфцнапнстнческнх Республик(088. 8) Государствениый комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения ИностранцыВальтер Шнайдер, Альберт Редер, Ханс Иеллеринг, Ингеборг Гутманн (ФРГ) Иностранная фирмаБерингер 11 аннхайм ГмбХ ф(54) СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ, СОДЕР%МЦИЙ УРЕАЗУ Изобретение относится к стабилизированным составам на основе уреазы, которые находят применение при определении мочевины.Энэим уреаза расщепляет мочевину с образованием угольной кислоты и аммиака, Характерной особенностью этого энзима является то, что в сыром состоянии уреаза чрезвычайно стабильна при хранении, стабильность же очищенной уреазы .сильно падает и уже при удельной активности приблизительно от 25 до 100 О/мг является неудовлетворительнойОбычная продажная уреаза с удельной активностью около 100 О/мг при полугодовом хранении теряет в холодильнике уже около 50 своей активности. Хранение при комнатной температуре или в растворенном виде приводит к еще более быстрой потере активности.Попытки повысить стабильность очищенного энзима в результате изменения значения рН буфера, ионной силЫ и типа буфера (малеат, цитрат, этилендиаминтетрауксусная кислота, фосфат) или в результате создания составов на основе уреазы, содержащих ломиью энзима соединения с сульфгидрильными группами, такиекак цнстенн илн меркаптоэтанол, оказались безрезультатными.Определенного небольшого повышения 6 стабильности удалось добиться с помощью состава, содержащего помимоуреазы дважды перекристаллизованныйальбумин плазмы быка (11.Однако достигаемая степень ста бильности оказалась недостаточнойдля использования этого состава,что было обусловлено относительнобыстрым разрушением знзима и падением его активности.1 Ь Цель изобретения - повышение стабильности.указанная цель достигается, согласно изобретению, составом для определения мочевины, который помимо ЯО уреазы содержит смесь глутатиона,этилендиаминтетрауксусной кислоты(ЭДТА) и тринатрийцитрата в кристаллической форме, содержащего 2 молекулы кристаллизационной воды, прн кб следующем соотношении компонентов уреазаг глутатион, этилендиаминтетрауксусная кислота: цитрат 1:(1-3):(13) г (1-3) .Предлагаемый стабилизированный ЭО состав содержит уреазу, предпочтительно предварительно обработанную сефадексом.Обработкой сефадексом удается почти удвоить активность энзима истабильность препарата Не поддающиеся стабилизации примеси в результате этой обработки удаляются, так что препарат уреазы на основе описываемого стабилизирующего состава отличается особенно высокой стабильностью после добавления смеси стабилизаторов. Обработку сефадексом можно производить как в результате однократного введения,сефадекса в раствор энзима, так и на колонке, Предпочтительно применение фсшитого сефадекса со свойствами молекулярных сит, так как при этом одновременно достигают обессоливание уреаэы наряду с обогащением и удалением мешающих примесей. Отличиями предлагаемого составаявляются наличие в нем помимо энэима глутатиона, этилендиаминтетрауксусной кислоты .(ЭДТА) и кристаллогидрата тринатрийцитата, а такжесоотношение компонентов соответственно 1;(1-3):(1-3):(1-3),Неожиданным оказался стабилизирующий эффект смеси названных трехвеществ (глутатион, ЭДТА, цитрат),хотя известно, что отдельные составные части этой смеси не обладаютстабилизирующим действием,Предлагаемый стабилизированныйсостав, содержащий уреазу, полученный после лиофилизации смеси после12-недельного хранения при 33 С,практически полностью стабилен и показывает 100 активности по сравнениюс исходной.Сам энэим после лиофилизации теряет активность от 30 до 80.Стабилизированный, согласно изобретению, состав, содержащий уреазу,применяется для определения мочевины,Он является таким устойчивым, чтопригоден для пропитки бумаги, пленкии тому подобных материалов-носителейили для получения реакционноспособных слоев на такого рода носителях.Если такого рода носитель или такогорода слой дополнительно содержит индикатор рН, то мочевину можно определить путем однократного изменения окраски.П р и м е р 1, 30 мг обычной продажной уреазы с удельной активностьюоколо 100 ц/мг растворяют в 1 млводы, пропускают через 5 мл геля сефадекса 6-50, предварительно уравновешенного цитратным буфером рН 7,0, соцержашим 0,5 2-меркаптоэтанола, инепосредственно после этого лиофилизируют. Лиофилизированный препаратподвергают затем испытанию на стабильность в результате храненияпри 33 фС.Во второй колонке повторяют описанный выше опыт, в котором к энэиму, обработанному сшитым сефадексом 6-50, добавляют глутатион, цитрат и ЭДТА в весовом соотношении 1:1:1:1. Затем повторяют лиофилизирование и хранение, как описано в первом опыте,Составные части хорошо перемешивают и добавлением 1 н, раствора НС 1 доводят значение рН до 6,0. Массу наносят на поливинилхлоридную пленку и высушивают в течение 60 мин при 60 фС. Прикапывают мочевинусодержашую кровь или сыворотку и после стирания ее через 90 с проявляется следующая окраска: 20 мгмочевины - желтый, 60 мгмочевины - желто-зеленый, 100 мгмочевины - зеленый, 200 мгмочевины - темно-зеленый. 55 60 В случае первого опыта без добавления стабилизирующего средства выходактивности после лиофилизации со,ставляет 20. После б-недельного хранения при 35 С замеренная остаточнаяактивность составляет менее 1.Во втором опыте со стабилизирующим средством, согласно изобрете 15 нию, активность после лиофилиэациисоставляет 100. Через 3 месяца активность также составляет 100.П р и м е р 2. 150 мг обычнойпродажной уреазы с удельной актив 20 ностью около 100 Б/мг растворяютв 100 мл воде, смешивают с 150 мгглутатиона, 150 мг цитрата и 150 мгЭдТА в весовом соотношении 1:1:1:1и без обработки сефадексом лиофилиэируют. В лиофилиэате определяютисходную активность, Она составляет 100,Лиофилизат подвергают затем хранению при 33 С. После б-недельногохранения активность составляет еше95 исходного значения.П р и м е р 3. Иэ обычной продажной уреаэы в результате многократнойкристаллизации иэ ацетон-цитратногобуфера и обработкой сефадексом полу 35 ч .т уреазу с удельной активытьюоколо 1500 ц/мг, Полученный препарат(10 мг) смешивают с 30 мг глутатиона, 30 мг цитрата и 30 мг ЭДТА в весовом соотношении 1:3:3:3. Устойчи 40 вость при хранении при ЗЗС соответствует уреазе 100 У/мг.П р и м е р 4. Испытательная пленка для определения мочевины (в кровиили сыворотке), Составные части:порошкообразный поливинилацетатпропионат 45,0 г, 1,93-ный растворнатрийальгината в воде 10,0 г диокстилнатрий-сульфосукцинат 0,5 г,стабилизированная уреаэа (1:1:1:1)плюс растворенный в воде (в 10 мл)бромтимолбляу, растворения в 5 млметанола, плюс 5 мл воды (10000 0),0,25 г динатрийгидрофосфат 0,9 г.743600 Формула изобретения Составитель О.Скородумова Редактор Т,Иванова Техред Р.Олиян Корректор В.Бутяга г Заказ 3517/53 Тираж,1019 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП фПатентф, г,ужгород, ул.Проектная,4 После 3-дневного хранения при60 фС эта испытательная пленка реагирует практически неизменной.Испытательная пленка. такого жесостава и изготовления, но котораясодержит вместо стабилизированной,согласно изобретению, уреазы нестабилизированную уреазу такой же активности, первоначально показываетпрактически такую же окраску приреакции, однако после хранения втечение 3 дней при 60 С более непригодна,1, Стабилизированный состав дляопределения мочевины, содержащий уреазу, о т л и ч а ю щ н й с я тем,что, с целью повышения стабильности,он дополнительно содержит смесь глутатиона, этилендиаминтетрауксуснойкислоты и тринатрнйцитрата в крнстал 5 лической форме, содержащего 2 молекулы кристаллизационной воды, при следующем соотношении компонентов уреаза:глутатион, этилендиаминтетрауксуснаякислота: цитрат 1:(1-3):(1-3):(1-3) .2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ н й с я тем, что уреаза предварительно обработана сефадексом.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. ЬУпп К,к, Воще РМРег 11 евапй РцгХЮ 1 са 1 опз ой Огеазе,В 1 осМщ 1 са е В 1 орйув 1 са Ас 1 а,1967, 146, р.205-218 (прототип),