Способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале

(22) Заявлено 15,12,75 (21) 2300323/23- с присоединением заявки РЙ 7 6 7/02 7 Р 7/08 Приорите сударствонный номнте СССР по долам нзооретоний и открытий(53) УДК 547.24 .07 (088.8) Дата опубликования опмсания 08,07, В, Янишполь А. А. Чуйко, В. А. Тертых, Е. И. Федорченко, А, С. Цыперович, И. П. Галич и Т. А. Кова чу Институт физической химии им. Л. В. ПисаржевскогоН Украинской ССР и Институт биохимии им, А. В. Паллади АН Украинской ССР(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕННА КРЕМНЕЕМСОДЕРЖАЩЕМ МАТЕРИАЛЕ тв к смеси цироввнным перечносши дегиды и г нила,Недоствтносится к улучшенному зации фермента на креммвтеривле, используе- и химической промышленмедицине. раствора фермента с модиф носителем, В качестве поИз способ неземетение иммобил ющих вгенто ользуют а я дисульф ержвще ишевой лоидные соедине мого ост акже особа яв ом известног обеими ункциональным ппам ти одит к уменого белка в ьщению н (до 29 с).сущности к предлагаеолее близок способ имнтв на кремнеземсодертутем взаимодействия и, что при ва связан ехнической группа количе По момуособу н ции фер атериал мобили ще щего материала, моди юпропилтриалкоксисисодержа ного ам и рова Иммобилизация ферментов позволяет5 продлить их активность и сделать пригодными для регенерации и повторного использования. Одним из способов иммобилизации ферментов является их коввлентное10 присоединение к носителям, которые могут быть как органическими, так и неорганическими. Последние обладают большей структурной стабильностью, мало чувствительны к изменениям рН среды и к мик 15 робиальным атакам.Известен способ иммобилизации фермента, заключающийся в том, что кремнезем- содержащий носитель обрабатывают орр- носиланом для введения функциональной группы, через которую носитель связывается с ферментом посредством поперечнс сшивающего агента 1. Связывание осуществляют путем добавления этого агенется то, что при добавлении поперечнсшивающего агента последний можеттолько соединять фермент с носителемно и осуществлять сщиввние молекул мого фермента, что приводит к снижениюферме нтвтивной активности получаемогопродукта до 30 ед/г. Кроме того, предлагаемые поперечносшиввюшие агенты моеагировать с привитыми к поверланом, с поперечносшиваюшим агентом,например с тиофосгеном, в среде органического растворителя с последующейобработкой полученного продукта буфернымраствором фермента при рН 9 2.Однако обработка крем:,еземсодержа 5щего материала, модифицированного аминопропилтриалкоксисиланом, тиофосгеном.длится около 4 ч,и вследствие невысокойактивности изотиоцианатных групп после 1 Одующая иммобилизация фермента на носителе длится около 2 ч,Целью изобретения является упрощениепроцесса за счет сокращения времени ре 1акции.33Цель дос,игается тем, что кремнеземсодержаший материал, модифицированныйаминопропилтриалкоксисиланом, подвергают взаимодействию с поперечносшиваюшим агентом, а именно с 2,4-толуилендииэоцйанатом, в среде органическогорастворителя с последующей обработкойполученного продукта буферным раствором фермента.Отличительным признаком предлагаемого способа является использование вкачестве поперечносшивающего агента 2,4-толуилендиизоцианата.Носителем могут быть кремнеземсодержащие вещества, предпочтительно вещества с большой удельной поверхностью, например высокодисперсная двуокись крем- ния.Носитель обрабатывают органосиланом для введения в поверхность реакционно- способных аминогрупп. Подходящим органосиланом является " -аминопропилтриэтоксисилан и ему подобные. Затем такой носитель обрабатывают 2,4-толуилендииэоцианатом с целью введения изоцианатных групп, способных в мягких условиях быстро взаимодействовать с ферментом, Благодаря различной активности иэоцианатных групп 2,4-толуилен диизоцианат взаимодействует с носителем более активной группой в положении 4.При этом изоцианатная группа в положении 2 остается на поверхности свободной и способна взаимодействовать с амино группами белка. Мольное отношение 2,4- -толуилендиизоцианата к концентрации аминогрупп на поверхности носителя составляет 0,8-0,9:3,0. При меньшем отношении уменьшается количество связывае- Н мого фермента, а при большем - носитель становится гидрофобным и плохо смачивается водой. Предлагаемый способ может быть использован для связывания ферментов через их аминогруппы, поэтому предпочтительно применять те ферменты, в которых аминогруппы не имеют существенного значения для проявления их активности,П р и м е р. 25 г высушенного при400 фС в течение 2 ч аэпосила с удельЯной поверхностью 175 м /г размешиваютв 250 мл толуола и к смеси добавляют5,6 г )" -аминопропилтриэтоксисилана.Смесь кипятят с обратным холодильником при перемешявании в течение 2 ч,промывают избытком толуола и высушиваоют в вакууме при 110 С. Концентрацияаминогрупп на поверхности полученногоаминоорганокремнеэема, определенная потенциометрическим титрованием хлорнойкислотой, составляет 1 ммоль/г.2,5 г аминоорганокремнезема размешивают в 25 мл. четыреххлористого углерода и к смеси добавляют раствор0,39 г 2,4-толуилендиизоцианата в 25 млчетыреххлористого углерода. После полного перемещивания смесь промывают избытком четыреххлористого углерода и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Полученный активированный носитель используют непосредственно длясвязывания фермента или хранят в ампулах, запаянных в вакууме.0,25 г фермента- с-амилаэы, содержащей 96-98% белка и обладающей амилолитической активностью 280000 ед/г,растворяют в 10 мл 1 М фосфатного буфера с рН 7,0, Затем при медленном перемешивании к раствору быстро прибавляют 1 г активированного носителя, Связывание осуществляют при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее иммобилизованный фермент поочередно промывают 1 М фосфатным буфером с рН 7,0.и 0,005 М раствором ацетата кальция срН 5,5 (по 200 мл) до исчезновенияамилолитической активности в промывныхжидкостях. Полученный продукт высушиваоют при 4 С и при этой же температурехранят в сухом виде,Высушенный продукт содержит 8-120 белка и обладает амилолитической активностью 800-1250 ед/г.Формула изобретенияСпособ иммобилизации фермента на кремнеземсодержашем материале путемОз 6722взаимодействия кремнеземсодержашего материала, модифицированного аминопропилтриалкоксисиланомс поперечносшивающим агентом в среде органического растворителя с последующей обработкой полученного продукта буферным раство- ,. ю ром фермента, о т. л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью упрощения процесса,в качестве поперечносшиваюшего агентаберут 2,4-толуилендиизоцианат,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Патент США % 366981, 195-63,опублик. 1972.2, Патент США М 35195381 195-63,опублик. 1968.Составитель О. МинаеваРедактор 3. Бородкина Техред И. Асталош Корректор И. МихееваЗаказ 3827/25 Тираж 512 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113 О 35, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4