Способ иммобилизации люциферазы светляков

"ф масс ъс: :,сост Е Е ОП ИИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(23) ПриоритетОпубликовано 231282. Бюллетень Йо 47Дата опубликования описания 03.01.83 И 1 М. Кл.з С 12 Ю 11/02 А 61 К 37/50 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения И.В,Березин, Н.Н.Угарова и Л.Ю.Бровко Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революциии ордена Трудового Красного Знамени государственныйуниверситет им. М.В.Ломоносова(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ Изобретение относится к неописан ному ранее способу получения иммобилизованной люциферазы светляков. Указанный фермент является уникальным для аналитического определения аденоэинтрифосфата (АТФ) в различных биологических препаратах, поэтому раз работка методов его получения, особенно в иммобилизованном состоянии, важна для целей медицинской биохимии, в частности для диагностики инфаркта миокарда. Растворимая люцифераза светляков является очень лабильным ферментом и легко инактивируется.Препарат люциферазы светляков за четыре дня хранения при комнатной температуре теряет почки 99 своей активности. В литературе отсутствуют данные о возможных путях ее стабилизации и создании таких нерастворимых форм Фермента, которые могли, бы быть использованы многократно. Предлагаемый способ основан на химическом методе иммобилизации путем образования ковалентной связи между ферментом и полимерным носителем, модифицированным введением групп способных реагировать с Фермент 13. Предлагаемый способ иммобилизации люциферазы светляков заключается в том, что слабощелочный экстракт лампочек светляков с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают при 2-15 С предварительно модифицирос ванными введением групп, способных реагировать с ферментом, полимерами на основе полисахаридов или полиакрилатов. Полученную твердую Фазу отделяют обычными приемами, Предпочтительно в качестве полимеров на основе полисахаридов использовать сефарозу или сефадекс, модифицированные ВкСМ, или - в качестве полимеров на основе полиакрилатов - полиметакриловую кислоту, модифицированную карбодиимидом,и процесс осу.ществляют при 2-5 оС.Цель изобретения - решить как проблему стабилизации люциферазы, так и проблему получения фермента, пригодного.для многократного использования.Сущность спосо 6 а заключается в следующем, Водный экстракт люцифера,эы, полученный экстракцией обеэвоженных лампочек светляков буферным раствором с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают предваритель)5 20 45 50 55 60 но модифицированными полисахаридамн (сефароза или сефадекс, обработанные ВкСБ, целлофан, модифицированный периодатом калия) или полиакрилатом(полиметакриловая кислота, модифицированная карбодиимидом) при 2-15 фС. Для предотвращения инактивации Фермен та все операции лучше проводить при 2-5 О С. Полученную иммобилизованную люциферазу отделяют известными приемами, например отфильтровывают. Ста бильность фермента, полученного спо. собом изобретения, в 10 раз (22 С) превышает стабильность растворимого фермента в тех же условиях.Выбор для иммобилизации люциферазы полимеров указанной природы (полисахариды, полиакрилаты) создает условия, при которых носитель химически взаимодействует преимущественно с молекулами белка и не взаимодействует с другими низко- и высокомолекулярными примесями, содержащимися в экстракте, в частности с субстратами люциферазы люциферином и АТФ. В 25 за 35 н 40 результате помимо иммобилизациипроисходит также очистка люциферазыот сопуствующих низко- и высокьмолекулярных примесей. П р и м е р 1. 60 мг предварительно высушенных над Са С 1 в вакуумелампочек светляков растирают в тонкий порошок и экстрагируют 3 млтрис-ацетатного 0,02 М буфера, 2 мМЭДТА, (этилендиаминтетрауксуснаякислота) 0,1 М Иа С , рН 7,9 при5 С в течение 30 мин. Полученную суспензию центрифугируют (15000 об/ми 5 С) в течение 10 мин, Раствор отделяют, а осадок промывают 2 мй тогоже буфера и вновь центрифугируют. Ксоединенным водным фракциям (5 мл)добавляют набухший порошок (283 мг)ВкСН актифированной сефарозы. Суспензию встряхивают при 4 фС в течение 25 ч. Полученный в результатеполимер с ковалентно присоединеннымк нему ферментом отделяют на пористом стеклянном фильтре и осадок промывают 10 раз по 5 мл попеременноацетатным буфером (0,02 М; 1 М БаС )и трис-ацетатным буфером (0,02 М;1 М ЯаС ), а затем 5 раз по 5 млдистиллированной водой до тех пор,пока в промывных водах люциферазная активность упадет до нуля. Полученный в результате препарат иммобилизованной люциферазы содержит 12от общей активности сырого экстракта. Суспензию хранят в 0,02 М трис-ацетатном буфере, рН 7,.75, 2 мМЭДТА. При хранении в течение месяцапри 4 С суспензия иммобилизованнойЛюциферазы сохраняет более 30 Ферментативной активности. П р и м е р 2. Экстракцию и иммобилизацию люциферазы проводят точно также, как указано в примере 1 при 2 С но в качестве носителя к сырому экстракту добавляют 260 мг полиметакриловой кислоты, предварительно обработанной 1-этил-З-(З-диметил-, -аминопропил)-карбодиимид гидрохлоридом. Полученный в результате препарат иммобилйзованной люциферазы,светляков содержит 8 от активности сырого экстракта.П р и м е р 3. Экстракцию и иммобилизацию проводят точно также, как указано в примере 1 при температуре 15 С. Полученный в результате препарат иммобилизованной люциферазы светляков содержит 0,09 от активности сырого экстракта.Применение иммобилизованной люциферазы светляков дает большие преимущества по сравнению с растворимым ферментом, так как появляется возможность многократного использования люцйферазы что значительно уменьшает расход дорогостоящего фермента. Послеиммобилизации резко возрастает срокхранения фермента, так в течение месяца при 4 С иммобилизованный Фермент сохраняет более 30 активности,в то время как препарат высокоочищенной растворимой люциферазы только4. Все выше указанное делает иммобилизованную люциферазу более перспективной для использования в клинических условиях для определения уровняАТфи АТФ - зависимых ферментов вразличных тканях. Существенным достоинством изобретения является то,что в качестве источника Ферментаиспользуется не чистый фермент, асырой экстракт, При этом в процессеиммобилизации достигается очисткалюциферазы от ряда сопутствующихнизко и высокомолекулярных примесей. формула изобретения 1. Способ иммобилизации люциферазы светляков, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что слабощелочный экстракт лампочек светляков с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают при 2-15 фС предварительно модифицированными введением групп, способных реагировать с Ферментом, полимерами на основе полисахаридов или полиакрилатов. 2, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем,что в качестве полимеров на основе полисахаридов используют сефароэу или сефадекс, модифицированные ВкСБ. 3. Способ по п.1, о т л и ч а ющи й с я тем, что в качестве полимеров на основе полиакрилатов исполь660378 СоставительРедактор Е.Зубиетова Техред Т.Маточка Корректор М.лароши Заказ 10871/13 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная,зуют полиметакриловую кислоту, модифицированную карбодиимидом,4. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что процесс ведут при 2-5 С. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Березин И.В. и Антонов В.К. Иммобилизованные ферменты. М МТУ, Э 1, 126-158, 1975.