Способ определения осахаривающей способности амилолитических ферментов

А Н Й-В ТЕН ИЯ О Союз СоаетсннкСоциалистическиРеспублик ВЖ 1-9856 ОБ СВИДВТВЛЬСТВ К АВТОБУС(б 1) Доп вт. свил в ельиое 7,77(21) 2463868/2822) Заявле 5 т) М 601 Н ЗЭ/14 ГесударетвеФааата Маеетае лйи эткубл аио 15 08 5 Дата опубликования описания Э 0.06.78 2) Авторы иэобрет С. Чере и А. П. Рухлядева(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСАХАРИВА СПОСОБНОСТИ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВЭта цель достигалагаемом способе овввшнхся сахаров осметрическим методо400-450 мм в пвекоторых проводят пе определен хари ости амнлолнтнчесматрнввюший феисследуемой иферментов солянлков и осветление образовавшихуюшим расчетом их рментаробы,рвстса- олиролнзом в исслею - после него, а аров ведут по фор у 1 Ж)1000(100) кдп+ Недостатком известного способа "является то, что определяют сумму всех углеводов, в расчет осахвриввюшей способности производят по какому-либо одному углеводу-глюкозе или мальтозе, преобла даюшему в растворе в большом количестве. Это приводит к занижению или завышению значения освхарнввюшей способ ности. Кроме того, известный способ применяют только для анализа ферментов 20 микробного происхождения.Белью изобретения являетние точности и воэможностиосахариввющей способности вких ферментов различного пр ОС и - осахврнваюаая спосабностЦ,К и 0,0104 коэффициенты, установленные экспериментально, причем К = 0,0838 и 0,0777,И ( Г 1 ) " количество препаратавзятого иа анализ, мг (мл);1000(100) - коэффициент перевода иэ мг в г на 100 мл жидкого гд укта; ся повыше 1 контролямилолитнчесоисхожд енияя. И Известен сносвающей способнферментов, предустнвный гидролнэинактивнроввниетой, освжпение бвора н определенхвров с последчестна 11 . с присоединеинек заявки ется тем, что в пред пределенне образоуществляют поляри- м при длине волями стадии, первую нз ред ферментативным дуемой пробе, в вторасчет количества м леОсаждеиие белков и осветление раствора проводят перед поляриметрическимметодом определения образовавшихсясахаров в растворах сернокислым цинком и ферроцианидом калия.Сущность способа заключается в сле 1дующем,В пробирку наливают последовательно10 мл раствора, 1 мл 1 н раствора соляной, кислоты, по 3. мл осадителей(30%-ный раствор сернокислого цинка1 Ои 15%-ный ферроцианнд калия) и 20 млсубстрата. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. Затем определяютв полученном растворе поляризацию наавтоматическом поляриметре в трубке15длиной 200 мм при Л й 400-450 им=1стадия поляризации, Пк.Одновременно проводят ферментатив, -ный гидролиэ исследуемой пробы притемпературе 50 С и рН й 4,8-4,9 (фосфатный буфер для солодов) и 4,7 (ацетатный буфер для 1 рибов), продолжительность реакции 30 мин, объем реакционной смеси 30 мл (20 мл субстрата и10 мл ферментного раствора). Для анали- р 5за берут пробирку размером: диаметр18 мм, длина 180. мм. Наливают в нее20 мм субстрата и ставят в ультратермостат (или водяную баню) с постояннойтемпературой . 50 С + 0,2 С.В термостате пробирку выдерживаютв течение 5-10 мин для того, чтобыраствор в ней принял температуру, прикоторой будет проведена ферментативнагреакция. Затем наливают в пробирку, находящуюся в термостате 10 мл рабочегоферментного раствора, также подогретоого до 50 С (солодовой вытяжки, осахаренного сусла, бражки и т. д,), перемешивают и оставляют стоять в термостате 30 мин,По истечении этого времени пробирку вынимают из термостата, добавляют 1 мл 1 н раствора соляной, 1 кислоты для инактивирования ферментов. Для осаждения белков и светления раствора гидролизата приливают 1 мл 30%-ного.раствора сернокислого цинка, а через некоторое время остаток сернокислого цинка удаляют прибавлением 1 мл 15%-ного раствора желтой кровяной соли,В полученном гидролизате определяю/1 поляризацию при той же длине волныстадия. Разность между значениями вращения плоскости поляризации, полученными на 1 истадиях, показывает значение снижения поляризации ( ь П)Осахаривающую способность рассчитывают по формуле, представляя в них измеренную величину,(К ЬП+0,0104) 1000(100)П 1 Р/)где К а 0,0838,0,0777 и 0,0104 - коэффициентыустановленные экспериментальнофРИ(11 ) - количество препарата, солода или жидкого продукта, взятого наанализ, мг (мл);1000(100) - коэффициент переводаиэ мг в г, и на 100 мл жидкогопродукта,1 П - разность оптического вращения растворов, полученных на 1 и11 стадиях,П О и м е р 1. На анализ взят зеленый ячменный солод, Приготавливают основной раствор - 5 г в 90 мл дистиллированной воды и 10 мл буферного раствора. Основной раствор разбавляют в 25раз. Следовательно, количество солода11 в мг, взятое для анализа, равно5 4 10 1000100100В исследуемой пробе осаждают белкии оставляют раствор сернокислым пинкоми ферроцианидом калия, а затем поляриметрическим методом при длине волны400 нм определяют образовавшиеся саха-ра получая при этом оптическое вращение раствора, равное 8,98 (Пк).Исследуек ую пробу подвергают ферментативному гидролизу, затем в нейинактивируют,ферменты соляной кисщьтой, осаждают белки и осветляктг раствор аналогичным образом.После этого проводят вторую стадиюопределения образовавшихся сахаров поляриметрическим методом при тех жепараметрах, при этом оптическое вращение раствора составляет - 8,26, (По).Определяют разность оптического вращения.1,Яэв 8-8 2 о ТдОПодставляем 11 и ЬП в формулу(0,07770,72+00101) 106. ОС-3 32 иск едг1Влажность солода 40%,Осахаривающая активность на абсолютно сухое вещество оавна:З, Зг 10 ООС . = = 5,5 З еЮ/г100- Фо - фП р и м е р 2, На анализ взж/ сусло, осахаренное глюкобататином ГХПодставляем значение в формулу Составитель Л. ПашинииаТехред Э, Чужик Корректор Н, Ковалем Редактор Т. Девятко Заказ 4499/41 Тираж 1112 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Советс Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгооод, ул. Проектная, 4фильтрат сусла разбавляют в 10 раз. Паанализ берут Измерение оптического вращения раст воров производят на автоматическом попяриметре, получая значенияПЙ,Ф 8; П,ф 10,8 Ф; ьй О,6+,%О,ОВЗВО,ва+ О,ООИ) 10 О=-.6,416 дИаоюл. Предлагаемый способ позволяет повысить точность и воэможность контроля15 осахариваюшей способности амилопитичес - ли ферментов различного происхождения.формула изобретения Способ определения осахариваюшей способности амилолитических ферментов, предусматриваюший ферментативный гидролиэ исследуемой пробы, инактнвирование ферментов соляной кислотой, осаждение белков и осветление раствора и определение образовавшихся сахаров с последуюшим расчетом их6 соличества, о т л и - чаюшийся тем, чго,сцепьюповышения точности и возможности контроля осахариваюшей способности амилолитических ферментов, различного происхождения,определение образовавшихся сахаров осушествдяют попяриметрическим методом при длине волны .400-450 нм в две стадии, первую из которых проводят перед ферментативным гицролизом в исспе. дуемой пробе, а вторую - после него а расчет количества сахаров ведут по Формуле(К аП+ О 0104)1000(100)иЛ (Л)где ОСп- осахариваюшая способность;К и 0,0104 - коэффициенты, установленные экспериментально, причемК = 0,0838 и 0,0777;й ( и) - количество препарата,взятого на анализ (мг или мл);1000(100) - коэффициент переводаиз мг в г на 100 млжидкого продукта;ЬП - разность оптиче скоговращения растворов,полученных на 1 и 3стадиях2, Способ по, п, 1, о т и и ч а ю -ш и й с я тем, что осажпение белкови осветление раствора проводят перед попяриметрическим методом определенияобразовавшихся сахаров в растворах сбрнокислым цинком и ферроцианидом калия,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе: 1, Бурштейн А. И, "Методы исследованин пищевых продуктов". Киев, 1963с. 435-439,