Способ получения гликопептида

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ с ) 5395 О 7 Союэ Советских Социалистических Республик(31) 583070 (33) СШАОпубликовано 15,12.76, Бюллетень % 4 Государственный комитет Совета Министров СССР УДК 615,45:616-00по делам нэобретени и открытийа опубликования описания 19,01.7 2) Авторы изобретен Иностранцы франк Бертеллини, Адриэно Бутти(Италия) Иностранная фирма Префар Проспекшн дэ Реверч фа) Заявитель мацеутикес СОБ ПОЛУЧ ГЛ И КОПЕПТИД ческо" енени х за Изобретение относится к фармацевти и промышленности и может найти прим е в медицине для лечения воспалительнь болеваний.Способа получения гликопептида в патентной и доступной литературе не описано.С целью получения гликопептида слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи и растирают в порошок, экстрагируют водой при 50 в 1 С в течение 10 - 45 мин при рН 1 - 10, подкисляют уксусной кислотой, фильтруют, гидрализат обрабатывают ацетоном, разбавляют водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзиматическому протеолизу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высушиванием.Способ осуществляют следующим образом, Слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой и нагревают при 50 - 100 С в течение 10 - 45 мин. Предпочитают проводить обработку при нагревании до температуры кипения, приближающейся к 100 С. Значение рН доводят до значений, которые могут находиться в пределах от 1 до 10 путем добавления кислот или щелочей. При рН выше 10 материал быстро разрушается. При значениях рН выше 9 ведут стро гий контроль за температурой и временем нагревания. По окончании гидролиза осаждают все органические вещества, обладающие кис лым характером, например серусодержащиемукополисахариды, Если гидролиз проводят при щелочной рН, смесь снова доводят до кислой рН путем добавления слабой кислоты, например уксусной, вызывая тем самым осаж дение этих веществ. Фильтрат затем освобождают от протеиновых отбросов путем обработки энзимами, например параином, в условиях с подходящим рН, Перед энзиматической обработкой проводят предварительное 5 осаждение большинства протеиновых отбросов путем добавления подходящего реагента, например трихлоруксусной кислоты. Разбавлением фильтратов органическими растворителями (спиртом или ацетоном) получают сы рой гликопептид в виде белого или светлокоричневого порошка. Затем от сырого продукта удаляют примеси соляного характера, Очистку осуществляют при помощи диализа, лиоо пропусканием через ионообменные смо лы кислотного или смешанного типа, Выходпродукта после очистки достигает 65 - 75% по весу, а полученный продукт представляет собой бесцветный без запаха аморфный порошок. Содержание фосфора и серы в очищенном продукте очень ничтожны. Отсутствуют также урановые кислоты, гликопептиды являются одним из типов гликопротеинов, структура которых является результатом сочетания полисахаридпых и протеиновых молекул с преобладанием полисахаридной части. Гексозамины содержатся в количестве 40 - 50%, аминокислоты 13 - 18%, гексозы 27 - 31% и производные нейрампновых кислот 4 - 6%.Фармакологические тесты на лабораторных животных показывают, что гликопептиды в дозах от 12,5, 25 или 50 мг/кг вызывают локальную эдему карагенином и серотонином, диффузию В 1 ие Еапза во внутрикожную полость серетонином, декстраном и брадихинином, а также рост гранулемы, вызванной ватным шариком у крыс. При дозах 100 мг/кг гликопептид уменьшает тяжесть язвенной болезни привратниковой части желудка и быстропротекающих язв.П р и м ер 1. 10,2 кг глубоко замороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи размалывают в мясорубке. Материал суспендируют в 10 л воды и кипятят при перемешивании в течение 15 мин, В процессе этой обработки рН раствора поддерживают равным 9,2 путем повторных добавлений Зн. гидроокиси натрия, К концу этого периода рН доводят до 4,7 добавлением 80%-ной уксусной кислоты (около 500 мл); смеси дают охладиться до 30"С, и после прибавления 10 л ацетона и 1 кг фильтрующего вещества (целит, целатум и т. д.) фильтруют через ткань под действием силы тяжести. Таким путем получают 22 л фильтрата, которые затем разбавляют 55 л ацетона. Таким путем продукт осаждают, собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают, Вес полученного таким путем сухого порошка приблизительно равняется 3 кг,Этот порошок диспергируют в 9 л воды,.рН раствора доводят до 5,7 с помощью 2 н. соляной кислоты, затем добавляют 20 г хлористого натрия и 20 г папаппа, и послс этого смссь нагревают при перемешивании до 60 С в течение 24 ч. Затем добавляют 50 г фильтрую- щего вещества и смесь профильтровывают через ткань под действием силы тяжести. Филь- трат концентрируют под уменьшенным давлением (50 мм рт. ст.) до объема 3 л и после этого обрабатывают 2,7 л ацетона. Полученный таким образом осадок, который собирался декантацпей, промываот ацетоном и сушат под вакуумом.Выход сырого гликопротеина приблизительно состазляет бб г.Найдено, %: Р 3,63; 5 0,21; Х 5,91; ацетильные группы 7,21, Вязкость 1%-ного раствора при 20 С 1,2699 ср; рН 1%-ного растгора 6,9.П р и м е р 2, 3,8 кг глубокозамороженной желудочной слизистой оболочки свиньи размалывают в мясорубке. Материал суспендируют и 7,5 л воды и кипятят при перемеши 5 10 15 2) 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ванин в течение 15 мин, В процессе этой обработки рН раствора поддерживают при значении 8,6 путем повторных добавлений 2 н. гидроокиси натрия, В конце этого периода сначала прибавляют 250 мл 80%-ной уксусной кислоты, а затем некоторое количество трихлорацетоуксусной кислоты (около 160 г), достаточное для доведения рН раствора до 1,8. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием и прозрачный фильтрат разбавляют ацетоном в количестве четырех объемов фильтрата. Осадок собирают фильтрованием, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают, Получают 47 г порошка, который подвергают папаиновому протеолизу после доведения рН до 5, по методу, описанному в предыдущем примере. Получают сырой продукт, который весит 20 г.Найдсно, " : Р 4; Х 6,2.П р и м е р 3. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи перемалывают на мясорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведения рН до 4 прибавлением 80%-ной уксусной кислоты кипятят при перемешивании.Смесь поддерживают при кипячении в течение 15 мин, затем ей дают охладиться и центрифугируют. Фильтрат обрабатывают 10 г ацетата натрия и затем разбавляют четырьмя объемами ацетона. Осадок отделяют декангацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Таким путем получают 11 г порошка, которые подвергают папаиновой протеолитической обработке после доведения рН до 5,7, как описано в примере 1.Сырой продукт, полученный по этой методике, весит 5,2 г. Найдено, %. Р 2,5; И 6,03.П р и м е р 4, 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи размалывают на мясорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведения рН до значения 1,7 добавлением трихлоруксусной кислоты нагреваютдо 50 С.Смесь поддерживают при этой температуре в течение 30 мин при перемешивании, и затем охлаждают и центрифугируют. Фильтрат обрабатывают 15 г ацетата натрия и затем разбавляют четырехкрагным объемом ацетона, Осадок отделяют декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Таким путем получают 9 г порошка, который подвергают протеолитической обработке папаином после доведения рН до 5,7, как описано в примере 1.Сырой продукт, полученный по этой методике, весит 4,8 г.Найдено, %: Р 2,6; Х 6,1.П р и м ер 5. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды, Суспензию с помощью центрифугирования освобождают от нерастворимой части и фильтрат обрабатывают 2 н, гидроокисыо натрия до значения рН 7,8. Полученный таким образом раствор подвергают диализу с деионизированной водой при 20 С539507 Формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор Л. Новожилова Техред М. Семенов Корректор Н. АукЗаказ 2770/18 Изд. Юе 1856 Тираж 630 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113636, Москва, Ж 36, Раущская наб д 45Типография, пр. Сапунова, 2 через целлюлозную мембрану толщиной 0,03 мм в течение 48 ч. В конце этой обработки раствор достигает объема 2 л. Раствор концентрируют до первоначального объема 1000 мл под уменьшенным давлением 50 мм рт, ст., обрабатывают 5 г хлористого натрия и разбавляют 1200 мл ацетона или 2500 мл метанола. Образовавшийся осадок собирают декантацией, промывают растворителем, применявшимся для осаждения, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 69 г.Продукт имеет следующие аналитические характеристики:Найдено, %, 5 0,25; 11 5,81; г 1 а 0,71; гексозамины 39,2; СНзСО 9,75.Вязкость 1 % -ного раствора при 20 С 1,6409 спуаз; рН 1%-ного раствора 6,3; урановых кислот нет; протеины содержатся в количестве 16,3/о (фолин); гексозы 29,5%, производные нейраминовой кислоты 4,55%.Пример 6. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды, Суспензию освобождают от нерастворимой части путем цснтрифугирования и фильтрат обрабатывают 150 мл смолы Амберлит 3 К 120 при комнатной температуре в течение получаса. Смолу затем промывают 100 мл дистиллированной воды и промывные воды объединяют с основным раствором. 5 г хлористого натрия добавляют и проводят осаждение из раствора путем разбавления 1320 мл ацетона. Образовавшийся осадок собирают декантацией н промывают 3 раза ацетоном, осадок затем вновь растворяют в 750 мл воды и рН раствора доводят до 6,2 с помощью обработки 2 н, ХаОН. 3 г ацетата натрия добавляют в водный раствор, разбавляют 2,5 об. его раствора ацетоном, посредством чего получают осадок, который собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 67 г,Найдено, %: Р 0,08; 8 0,2; И 6,03; СНзСО 9,34; Иа 0,43; гексозамипы 39,5; урановых кислот нет; гексозы - 29,5; протеины (фолин) 14,0; производные нейраминовой кислоты 5,33. 6рН 1%-ного раствора 6,2. Вязкость 1/о-ногораствора при 20 С 1,9189 спуаз.Пример , 100 г сырого гликопротеина,полученного по методике примера 1, суспен 5 дируют в 1 л воды, Суспензию освобождаютот нерастворимой части с помощью центрифугирования и фильтрат обрабатывают100 мл смолы Амберлит ЗК 120. Через30 мин после этой обработки смолу отделяют10 фильтрованием и промывают 100 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объединяют с фильтратом. Этот раствор обрабатывают 100 мл Амберлита И А 410 дополнительно в течение 30 мин. Смолу отделяют15 фильтрованием и промывают 150 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объединяют с фильтратом и рН доводят до 6,2 спомощью добавления 2 н. ХаОН. Добавляют5 г ацетата натрия с последующим разбавле 20 вием равным объемом ацетона. Образовавшийся осадок собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают, Выход 70 г,Найдено, /,: Р 0,04; 5 0,11; Ка 0,27; аце 25 тильные группы 0,93; Х 5,74; гексозамины 40;урановых кислот нет; протеины (фолин) 14,5;гексозы 31; производные нейраминовой кислоты 5,20.рН 1%-ного раствора 6, Вязкость 1%-ного30 раствора при 20 С 1,9004. 35Способ получения гликопептида, о т л и ч ающи й ся тем, что, слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой 40 при 50 - 100 С в течение 10 - 45 мин при рН1 - 10, подкисляют уксусной кислотой, фильтруют, гидролизат обрабатывают ацетоном, разбавляют, водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзиматическому про теолпзу папаином или трипсином с последу.ющей фильтрацией смеси и высушиванием.