Способ получения -триптофана

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 11) 480758 Союз Советских Социалистических Ресоублик(22) Заявлено 02,12,72 (21) 1854139/28-1 с присоединением аявкиГосударственный комите овета Министров СССР ло лелем изобретений и откоытий(71) Заявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1;ТРИПТОФАНА Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению 1.-триптофана методом глубинной ферментации с помощью микроорганизмов.Известен способ получения 1.-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его оактерий Вас 111 цз зцЬШ 1 з. Генетика, не нуждающихся при синтезе 1.-триптофана в предшественнике, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода - мелассу, гидрол, пищевой сахар, в качестве источника азота - мочевину, куку. - рузный экстракт, а также необходимые минеральные соли, с последующим выделением 1.-триптофана из культуральной жидкости и получением кристаллической аминокислоты. Для увеличения выхода 1.-триптофана предлагается из микроорганизмов Бас 11 цз зцЬИЬ использовать штаммы Генетикаи Гене тика, при этом источник углерода вводить в среду в количестве 150,0 - 100,0 г/л (по сахару), а источник азота - в количестве 15,0 - 10,0 г/л (по сухому весу).Штамм Генполучен из штамма Ген25 в итоге четырех последовательных ступеней отбора по признаку продуктивности при отработке клеток раствором И-метил-К-нитрочнитрозогуанидином в концентрации 500 мгк/мл и экспозиции в растворе 15 мин. 30 А, Великжанина, Л, А. Минеева,Рошаль и Л, М, Евстюгов-Бабаевательский институт генетикиных микроорганизмов Штамм Генполучен в результате обработки клеток штамма 1 ентаким же раствором указанного мутагена и проведения двух ступеней отбора на продуктивность.Культурально-морфологическая характеристика штаммов Гени Ген, Штаммы являются грамположительной спорообразующей палочкой. Колонии обоих штаммов на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации при 37" С достигают 8 - 10 мм в диаметре, сплошные, круглые, с изрезанным краем, поверхность - гладкая со слабой радиальной по краю и концентрической в центре исчерченностью. Посев каждого штамма штрихом на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации при 37 С дает умеренный рост, штрих - широкий с мелкозубчатым краем, запах - характерный, консистенция - рыхлая, маслянистая, цвет - серовато-белый. Рост каждого штамма на мясо-пептонном бульоне после 1 сут инкубации при 37 С характеризуется умеренным помутнением среды без образования пленки, запах - характерный, осадок - скудный, тягучий при встряхивании, через 3 сут помутнение уменьшается.Колонии на агаризованной минеральной среде Спицайзена с глюкозой после 3 сут инкубации при 37 С у штамма Гендостигают 0,8 - 1,2 мм в диаметре, сплошные, круг. лые с гладкой блестящей поверхностью, гряз.(по сухому весу)0,61,41,00,57,5 Кукурузный экстракт КН,Р 04К 2 НР 04Мд 504 7 Н 20МаС 1МочевинаВодопроводная водарН перед стерилизацией доводят щелочью до 6,8 - 7,0. Ферментационную среду без мочевины стерилизуют в ферментере при 124 - 126 С в течение 1 ч, после чего охлаждают до 37 С, Мочевину в виде 40 о -ного раствора стерилизуют отдельно при 0,5 атм в течение 30 мин и добавляют в основную среду перед посевом. Ферментацию ведут в 20-литровых ферментерах, оборудованных турбинной мешалкой, барботером и системой автоматического пеногашения, при 37 С, непрерывном перемешпванип 3но-белого цвета, внутренняя структура в однородная.Штамм Генобразует в этих условиях точечные колонии, не превышающие 0,5 мм в диаметре.При добавлении к среде 100 мкг/мл 1.-фенилаланина диаметр колоний достигает у штаммов Гени Ген1,5 ма и 1,2 мм соответственно, Рост на жидкой минеральной среде Спицайзена (24 ч инкубации при 37 С, качалка) у штамма Генхарактеризуется слабым струйчатым помутнением среды, у штамма Ген- помутнение еще более слабое. Рост обоих штаммов в указанных условиях стимулируется 1.-фенилаланином. Отношение к Р 1.-5-метилтриптофану. Оба штамма при посеве на чашки Петри со средой Спицайзена, содержащей 1000 мкг/мл 01.-5- метилтриптофана и 20 мкг/мл 1.-фенилаланина способны образовывать колонии (100% выживаемости) при некотором замедлении роста и уменьшении диаметра колоний.П р и м е р 1. Культуру Вас 111 цз вцЬ 1111 з Генподдерживают на столбиках с 0,7 - ным агаром Хоттингера. Для выращивания посевного материала односуточную культуру, инкубированную при 37 С, пересевают в колбы Эрленмейера объемом 750 мл с посевной средой следующего состава, г/л:Сахар-сырец 50,0Кукурузный экстракт 20,0 КНРО 0,6 КН 2 Р 04 1,4 рН посевной среды доводят при помощи МаОН до 6,8 - 7,0. Среду стерилизуют 30 мин при 0,8 атм. Объем среды в колбах 150 мл. Посевной материал выращивают в течение 18 - 20 ч на качалке (200 - 300 об/мин) при 28 - 30 С. Титр клеток в посевном материале достигает 1 - 3 10 кл/мл, Для засева ферментационной среды посевной материал добавляют в количестве 3 - 5 об. %.Ферментационная среда имеет следующий состав, г/л:Меласса(по сухому весу)КН 2 Р 04 0,6 К 2 НР 04 1,4 Мф 04 7 Н 20 1,0 40 ИаС 1 0,5Мочевина 7,5Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 10,1 г/л 1.-триптофана. 45 П р и м е р 4. Штамм-продуцент, выращивание посевного материала, как в примере 2.Отличие в составе ферментационной среды,Ферментационная среда содержит, г/л:Мел асса 100,0 50 (по сахару)Кукурузный экстракт 10,0(по сухому весу)КНР 04 0,6КНРО 1,4Мг 504 НО 1,0ХаС 1 0,5Мочевина 5,0Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 8,2 г/л 1.-триптофана.60 П р и м е р 5. Штамм-продуцент, выратцпвание посевного материала, состав ферментационной среды, как в примере 4, но в качестве источника углерода добавлен сахар(1000 об/мин) и аэрации. Количество подаваемого воздуха составляет 1 объем на 1 объемсреды в 1 мин.После 65 - 72 ч в культуральной жидкостинакапливается 9,5 г/л 1.-триптофана, которыйвыделяют известным способом с помощью ионного обмена,Г 1 р и м е р 2. Штамм-продуцент, выращивание посевного материала то же, что в приме 1 О ре 1. Отличие состоит в составе ферментационной среды и условиях ферментации.(по сухому весу)КНР 04 0,6К 2 НР 04 1,4Мд 504 Н,О 1,020 МаС 1 0,5Мочевина 5,0Ферментацию проводят методом глубинногокультивирования в колбах Эрленмейера (емкость 250 мл с двумя отбойниками), содер 25 жащих 30 мл среды, на качалке (200 - 220об/мин) при 30" С,Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 8,2 г/л 1.-триптофана,П р и м е р 3. Штамм-продуцент, выращиЗО ванне посевного материала, как в примере 1,условия ферментации, как в примере 2. Ферментационная среда содержит, г/л:480758 Составитель В. Якубина Текред Т. Миронова Корректор О. Тюрина Редактор Л. Тюрина Заказ 31242 Изд. М 1676 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб д, 415Типографии, пр. Сапунова, 2 5П р и м с р 6, Штамм-продуцент Вас 111 цз вцЬШ 1 з Ген. Выращивание посевного материала, состав ферментационной среды, условия ферментации, как в примере 3.Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 7,8 г/л 1.-триптофана.П р и м е р 7. Штамм-продуцент Вас 111 цз ьцЬЫ 1 з Ген. Выращивание посевного материала, состав ферментационной среды, условия ферментации, как в примере 4.Через 72 ч выход 1.-триптофана составляет 6,7 г/л. Предмет изобретенияСпособ получения 1.-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его бактерий Вас 111 цз зпЬ 111 з, не нуждающихся при синтезе 1.-триптофана в предшественнике, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода - мелассу, гидрол, пищевой сахар, в качестве источника азота - мочевину, кукурузный экстракт, а также необходимые минеральные соли с последующим выделением 1.-триптофана из культур альной жидкости, отличающийся тем, что, с 1 О целью увеличения выхода 1.-триптофана, измикроорганнзов Вас 111 цз зцЫ 111 з используют штаммы Генетикаи/или Генетика, при этом источник углерода вводят в среду в количестве 150,0 - 100,0 г/л (по сахару), а 15 источник азота - в количестве 15,0 - 10,0 г/л