Способ получения антигена для серологических реакций при безноитиозе животных

О П И С А Н И Е 368863ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Соеетскик Социалистических РеспубликЗависимое от авт. свидетельства М Заявлено 25.1.1971 (Ле 1616731/30-15)с присоединением заявки МдПриоритетОпубликовано 0811,1973, Бюллетень М 1Дата опубликования описания 28 Х.1973 Е 23/00 тет по делам изобретений н открытн ДК 619,616.9.993.11 рн Совете Министров СССРЗаявител СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИ РЕАКЦИЙ ПРИ БЕЗНОИТИОЗЕ ЖИВОТНЫХ(физиологический раствор).7. О,1 и. раствор соляной кзиологцческом растворе хлори сого три мощизна- ханилоты на фиого натрия. Изобретение относится к способам получения биологических препаратов, а именно нативных протозойных, гельминтозных антигенов.Известны способы получения антигенов из инвазионного материала, из которого путем ферментативного гидролиза получают очищенные цисты ВезпоШа Ьезпо с последующим шуттелированием, гомогенизированием и обезжириванием эфиром.Однако этот способ очень продолжителен, трудно получать стандартный антиген.Цель изобретения - получение стандартного и высокочувствительного антигена для серологических реакций при безноитиозе крупного рогатого скота, реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой, гемагглютинации (РНГА), реакции преципитациц в агаровом геле (РП-гель).Предлагаемый способ позволяет получагь стандартный ацтиген.Способ осуществляют путем применения трех технологических этапов: извлечение ц очистка цист В, Ьезпой (исходного материала), дезинтеграция цист ультразвуком, изоионное фракционирование ультразвукового лизата.Цисты безноитий получают,при по специальной среды (растворов с низким чением рН), которую используют для ме ческого извлечения цист цз соединительной ткани крупного рогатого скота, пораженного безноитиозом, и окончательно очищают их от остатков структурных элементов ткани ферментативным перевариванием. Для получения антигена очищенные цисты дези нтегрируют ультразвуком, чтобы экстрагцровать активное начало бензоцтцй, после чего из озвученной среды (лнзата) путем цзоцоцного фракццонировация (осаждения в изоэлектрнческой точке) выделяют основную антцгенную фракцию, свободную от неспецифических балластных веществ.Помимо безноитиозного ацтнгеца способ позволяет получать токсоплазмеццый, финнозный, цистццеркозный, туберкулезный и бруцеллезный антцгены,Способ приготовления антигена заключается в следующем.Извлечение и очистка цист В, Ьезпой. 3 - 5 г фарша соединительной ткани, пораженной цистами безноитий, дополнительно измельчают ножницами, переносят в сосуд размельчителя тканей, заливают 300 - 400 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 8) и гомогенизируют 5 - 7 мин. Полученную смесь центрифугируют при 1000 - 1500 обмин в течение 1 - 2 мин. Надосадочную жидкость, содержащую мукополисахариды, удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок ресуспендируют в 300 - 400 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе и переносят в сосуд размельчителя тканей. Снова гомогенизируют 5 - 7 лин, смесь центрифугируют при том же режиме с последующим удалением надосадочной жидкости. Эту процедуру повторяют 3 - 5 раз до полной прозрачности надосадочной жидкости. После этого осадок, содержащий цисты, переносят в химическую колбочку с 50 - 100 мл 0,5%-ного раствора пепсина на 0,05 М раствора тетраоксалата калия с 0,85 О/о хлористого натрия (раствор 9) и ставят в термостат при 37 С. Через каждые 1 - 2 час из ферментативной смеси пастеровской пипеткой на предметное стекло наносят каплю пробы для микроскопического контроля очистки цист. Цисты микроскопируют под малым увеличением микроскопа. Ферментативное переваривание ведут до полного освобождения цист от остатков коллагеновых и мышечных волокон (в среднем 4 - 6 час), После окончания переваривания цнсты 2 - 3 раза отмывают на микроразмельчителе тканей гомогенизированием в 50 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 8) в течение 2 - 3 лшн. В осадке находятся извлеченные и очищенные от остатков тканей цисты безноитий.Очищенные цисты используют для изготовления антигена непосредственно после получения или хранят в физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 6) с добавлением мертиолата 1: 10000 при 4 С.Дезинтеграция цист В. Ьезпойг. Дезинтеграцию проводят в специальном сосуде с водяным охлаждением для предотвращения нагревания озвучиваемой среды, В сосуд вносят 2 - 3 г (по сырому весу) очищенных цист безноитий и заливают 50 - 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 7),Дезинтеграцию осуществляют с помощью УЗДНвоздействием ультразвуковых волн частотой 22 - 35 кгц/сек в течение 45 - 90 мин (в зависимости от степени очистки цист) до просветления обрабатываемой среды.Озвученная среда представляет собой беловато-сероватую жидкость с небольшим количеством осадка, состоящего из крупных взвешенных частиц, осколков оболочек цист и отдельных неразрушенных цист безноитий65 жидкой части центрифугированием в течение Осадок отделяют от жидкой части центрифугированием в течение 15 - 20 л 1 ин при 8000 - 10000 об/мин и затем растворяют в 20 - 30 мл дистиллированной воды при рН, равном 5 9 - 10, и температуре 35 - 40 С. Нерастворившуюся часть осадка удаляют центрифугированием при том же режиме.Из надосадочной жидкости (Л) и растворенного осадка (Б) изоионным фракциони рованием выделяют специфическую антнген 1- ную фракцию.Выделение антигенной фракции из надосадочной жидкости (А). Надосадочная жидкость является основным материалом для по лучения безноитиозного антигена. Эту антигенную фракцию выделяют медленной нейтрализацией (изменением рН) надосадочной жидкости растворами едкого натра. Для этих целей используют 15, 10, 5 и 2,50/о-ные рас творы едкого натра, При усреднении надосадочной жидкости в пределах рН от 3,5 до 5,5 выпадает обильный осадок. Формирование осадка происходит быстро и полно (крупными хлопьями) в изоэлектрической точке при 25 рН, равном 4, и температуре 35 - 40 С.Эту специфическую аптигенную фракцию(фракция 1) отделяют от жидкой части центрифугированием в течение 15 - 20 мин при 8000 - 10000 об/мин, Если надосадочную жид кость подвергнуть дальнейшему подщелачиванию, то в пределах рН 90 - 105 может произойти выпадение незначительного количества второго осадка (фракция 2). Выпадение этого осадка прежде всего зависит от коли чества цист, взятых для дезинтеграции, ихкачества, полноты разрушения (дезинтеграции), точного установления изоэлектрической точки (рН 9,6) и температуры (35 - 40 С).После центрифугирования и отделения вто.40 рого осадка (при, 8000 - 10000 об/мин в течение 15 - 20 мин) надосадочная жидкость еще содержит вещества, дающие слабую положи= тельную реакцию на белок с реактивом Фолина, которые однако нельзя осадить в изо электрической точке без предварительногоконцентрирования надосадочной жидкости (фракция 3).Исходя из того, что из трех фракций основ=ной (серологически высокоактивной и специ= 50 фической) является фракция 1, весь процессвыделения из надосадочной жидкости ан 1 тигенной фракции практически сводится к осаждению только фракции 1.Выделение антигенной фракции из раство ренного осадка озвученной среды (Б). Изосадка озвученной среды, суспензированного в 20 - 30 лл дистиллированной воды, медленной нейтрализацией 10, 5 и 2,5% -ными рас= творами соляной кислоты при рН 3,5 - 5,5 60 (изоэлектрическая точка рН) и температуре35 - 40 С осаждают антигенную фракцию, которая тождественна основной антигенной фракции 1 из надосадочной жидкости озвученной среды. Эту фракцию отделяют от368863 Предмет изобретения Составитель Р. Махнюк Релактор Е. Хорнна Корректор Е. Михеева Техрел Т. Ускова Заказ 1750/2 Изл.1388 Тираж 467 ПодписноеЦ 11 ИИПИ Комитета по лелам нзобретсшгй и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж.35, Раушская наб., д. 4,5 Типография, пр. Сапунова, 2 15 - 20 мин при 8000 - 10000 обмин и соединяют с ранее полученной фракцией 1. Надосадочную жидкость, содержащую балластные вещества отбрасывают.Приготовление безноитиозного антигена, Осадки антигенной фракции с изоэлектрической точкой рН, выделенные из надосадочной жидкости (Л) и осадка озвученной среды (В), трехкратно промывают в дистиллированной воде центрифугированием при 8000 - 10000 обмин в течение 10 - 15 мин и затем растворяют в предельно малом объеме подщелаченной дистиллированной воды (30 - 50 мл) при рЕ 1 9,0 - 9,5 и температуре 35 - 40 С. Этот раствор является безноитиозным антигеном.Приготовленный таким образом безноптпозный антиген не обладает антикомплементарвями свойстгами. Он проявляет высокую активность н специфичность в реакции связывгния комплемента и других серологических реакциях. Хорошая растворимость антигена в дистиллированной воде позволяет различные серии этого препарата стандартизировать 5 по содержанию белка,Для длительного хранения безноитиозныйантиген консервируют мертиолатом (1: 10000) и ."табилизируют очищенной желатиной или лиофилизируют в защитной среде.10 Способ получения антигсна для серологических реакций при безноитиозе животных, 15 включающий извлечение и очистку цистВезпо 11 а Ьевпо 111, отличагоциися тем, что, с целью стандартизации антигена, цисты дезинтегрируют ульгразвуком, после чего проводят гыдсление активной и специфической фрак ции путем изоионного фракционнрования.