Способ иммунологической диагностики туберкулеза

.05.87. медицине ммунодиа ение точно ющим обраГОСУДАРСТ 8 ЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Центральный научноский институт туберкулеза(56) Авторское свидетельпо заявке М 4286888, 11(54) СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА(57) Изобретение относится к медицине,именно к методам иммунодиагностики туберкулеза. Цель изобретения - повышени Изобретение относитсяиологии, а именно к методаостики туберкулеза. Цель изобретения - повы ти способа, Способ осуществляют сле зом.Антиген - гликопептид клеточной оболочки микробактерий БЦЖ фиксируют на полистероловых круглодонных 96-луночных планшетах в количестве 20 мкг/мл или 2 мкг на 100 мкл на лунку в карбонат-бикарбонат- номбуфере рН 9,6 втечение 16-24 ч при 4 С. По окончании сорбции раствор антигена удаляют сильным встряхиванием, после чего планшет закрывают крышкой, герметично заклеивают лейкопластырем и хранят при 4 С до 6 мес без потери биологической активности,точности способа, Пеедварительно из туберкулезного микроба (штамм БЦЖ) выделяют гликопротеид, который используют в качестве антигена. У больного берут кровь, выделяют сыворотку, которую разводят1:200 и вносят в микроячейки планшета, сенсибилиэированные антигеном, параллельно с разведенной сывороткой здоровых, после чего проводят иммуноферментный анализ и определяют оптическую плотность в обеих пробах и при увеличении ее значения в пробе с сывороткой крови больного по сравнению с пробой с сывороткой здоровых более чем на 0,2 единицы диагностируют туберкулез. Достигается увеличение точности на 4%,Перед постановкой реакции планшет отмывают три раза фосфатно-солевым буфером 0,1 М рН 7,2, содержащим 0,05% твин.Готовят основные разведения исследуемых сывороток больных 1:200 на фосфатно-солевом буфере 0,1 М рН 7,2, содержащем 0,05% твин, Растворы анализируемых сывороток в количестве 100 мкл вносят в трех порциях в лунки планшета, Обязательно на каждом планшете ставят контрольные сыворотки - положительную и отрицательную, Планшет выдерживают в термостате при 37,5 С в течение 60 мин, после чего жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают как описано.Во все лунки планшета вносят по 100 мкл пероксидаэного конъюгата в рабочем разведении 1:500, которое устанавливают510 15 20 25 30 35 40 50 55 предварительным титрованием конъюгата каждой серии, Планшеты выдерживают при 37 С 1 ч. После аналогичного отмывания вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстрат доводят до рН 5,9-6,0 0,1 И МаОН. Субстратную смесь готовят непосредственно перед заполнением лунок путем соединения субстрата и перекиси водорода в соотношении 10:1, Субстрат - 0,08 оь-ная 5-аминосалициловая кислота - готовят на дистиллированной воде, подогретой до 65 С, После охлаждения до 20 С устанавливают рН 5,9%6,0 с помощью 0,1 М МаОН, Затем вносят по 10 мкл в лунку и выдерживают в течение 60 мин в защищенном от солнца месте. Результат реакции учитывают инсточментально на знзиметре - вертикальном спектрофотометре типа "Мультискан" на длине волны 450+3 нм, Вычисляют среднее значение иэ трех параллельных определений для каждой сыворотки, В каждом планшете ставят контрольную положительную и контрольную отрицательную выделенную из крови донора) сыворотки. Результат анализа указывает на туберкулез, если экстинция исследуемой сыворотки превышает таковую в отрицательном контроле на 0,2. Чистое время проведения способа занимает" ч.Для получения гликопептида 1,0 г сухого веса клеточных оболочек БЦК экстрагируют 10 мл 13,ь-ного, тритона Хна магнитной мешалке, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20-30 мин, Надосадочную жидкость по каплям вливают в 100 мл ацетона и оставляют на 20 ч для формирования осадка, затем ацетон над осадком удаляют и осадок центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. Полученный осадок промывают 2 раза эфиром и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, Осадок сушат в термостате. К сухому осадку добавляют постепенно 3 мл физиологического раствора, оставляют на ночь в холодильнике для лучшего экстрагирования, затем центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин, К осадку добавляют 1 мл физиологического раствора, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочные жидкости первого и второго центрифугирования объединяют и получают фракцию гликопептида.П р и м е р, Больной К, поступил в диагностическое отделение с подозрением на инфильтративный туберкулез легких или острую пневмонию, Бактериоскопия мокроты не выявила микобактерий туберкулеза. Иммунологическое исследование не дало точного ответа на этиологический фактор заболевания. У этого больного берут 2,5 мл крови, из которой общепринятым способом получают 1 мл сыворотки и проводят определение антител к гликопептиду клеточной оболочки в ИФА, Для этого планшет, сенсибилизированный данным антигеном в дозе 2 мкг на лунку и хранившимся при 4 С, был отмыт 3 раза 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,05-ный твин, Разведения исследуемых сывороток 1:200 на том же буфере в количестве 100 мкл наносят на три параллельные лунки планшета. В таком же разведении поставили контрольные положительную и отрицательную сыворотки в трех параллельных лунках. Планшет выдерживают в термостате при 37,5 С в течение 60 мин. Затем жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают как описано. Затем во все лунки вносят по 100 мкл ферментного пероксидазного конъюгата, иэготовленного в разведении 1:500, Планшеты выдерживают при 37,5 С в течение 1 ч. После аналогичного отмывания вносят по 100 мкл субстратной смеси, приготовленной соединением субстрата и перекиси водорода в соотношении 1 О:1. При этом субстрат ,(0,08 О- .ную 5-аминосалициловую кислоту) готовят на дистиллированной воде, подогретой до 56 С. После охлаждения до 20 С устанавливают рН до 5,9-6,0 с помощью 01 МаОН, Планшеты выдерживают 60 мин в защищенном от света месте. Результат реакции учитывают инструментально на вертикальном спектрофотометре типа"Мультискан" при длине волны 450+0,3 нм, вычисляют среднее значение из трех параллельных разведений каждой сыворотки, включая контрольные.Экстинция исследуемой сыворотки (0,597) превышает таковую в отрицательном контроле (0,085), на 0,512, т,е, разница выше 0,2, что указывает на наличие у данного больного туберкулеза.С помощью предлагаемого способа выявление больных туберкулезом увеличивается на 4 оь по сравнению с известным (94 6 больных выявляются предлагаемым способом и только 90% известным) и на 4;4 возрастает точность способа (у здоровых доноров только в 1 о/, наблюдается ложноположительных проб при использовании предлагаемого способа и 5- известного).Формула изобретенияСпособ иммунологической диагностики туберкулеза, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее в ячейках микропланшета, сенсибилиэированных анти еном, с последующим выявлением количества антител с помощью иммуноферментного анализа по оптической плотности,Заказ 2837 Тираж 389 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве антигена используют гликопротеид клеточной стенки туберкулезной бактерии штамма БЦЖ, а перед инкубацией сыворотку боль ного разводят 1;200 и при увеличении оптической плотности в пробе с сывороткой больного по сравнению с пробой сыворотки от здоровых более чем на 0.2 единицы диагностируют туберкулез,