Способ получения трофобластического бета -гликопротеина

/04 51 И А 6 ТЕЯЙЯ леи не Осонативности дуляторных ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА 1-ГЛИКОПРОТЕИНА(57) Изобретение относится к биологической химии и касается способа получениятрофобластического бета 1-гликопротеина. Изобретение относится к биологической химии, а именно к препаративной и биологической технологии и может быть использовано в технологии получения очищенного препарата трофобластспецифического бета-гликопротеина (ТБГ), содержащегося в биологических жидкостях и тканях,ТБГ является необходимым препаратом для иммунодиагностики беременности, ее патологий, а также для диагностики злокачественных новообразований, развиваю.- щихся иэ трофобласта (элементов хориона); В будущем возможно применение препарата ТБГ для получения антифертильных анти- сывороток и, в связи с обнаружением у этого белка иммунорегуляторных свойств, как иммуномодулятора при некоторых нарушениях иммунорегуляторной функции организма.Если для диагностических цебенно важна высокая степеньданного белка, то для иммуномо Целью изобретения является сокращение времени. Способ осуществляется путем обработки сыворотки ретроплацентарной крови или осадка Ав, полученного при производстве гамма-глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови, сульфатом аммония, затем осадок растворяют в воде и последовательно подвергают гель-фильтрации на сефадексе Гв 0,02 М аммонийацетатном буфере, затем ионаобменной хроматографии а ДЕАЕ-целлюлозе, затем подвергают целевой продукт аффинной хроматографии на сефарозе, с иммобилизованным цибакрон-синим и гельфильтрации на сефадексе, Г. применений ТБГ должен выделяться в особо мягких условиях. В настоящее время в качестве сырья для получения ТБГ используется сыворотка крови беременных женщин, сыворотка ретроплацентарной крови, плацента, а также отходы сырья, используемого для производства гамма-глобулина иэ ретроплацентарной крови, чаще всего осадок Ав,Данный способ принят нами за протоЦелью изобретения является сокращение времени выделения (с 4-5 суток до 20 ч).Отличительными признаками изобретения является то, что применяемая последовательность действий, состоящая из концентрирования (осаждение сульфатом аммония), гельфильтрации, при которой происходит определенное разведение материала при его очистке, концентрирование при ионообменной хроматографии и аффинной хроматографии, разведение при гель- фильтрации в системе летучего буфера споследующей лиофилизацией позволяет не применять диализа, при котором особенно расходуется время из-за продолжительности каждой пороцедуры диализа 1-2 суток. и позволяет получить целевой продукт.прак тически без примесей солей, так как при гельфильтрации происходит заодно и обессоливание, Кроме того, используются широко известные и общепринятые в препаративной белковой химии реактивы: сефадексы и ДЕАЕ целлюлоза, а для аффин- . ной хроматографии используется иммобилизованный цибакрон синий краситель - аналог голубой сефарозы(способ получения которого защищен нами А.с. 968040 авт. Терентьев А.А. и др.), можно также использовать и фирменную "Голубую сефарозу" (Швеция, Фармация файн Кемиклз), Отсутствие диализа в нашем способе получения способствует наибольшей сохранности нативности белка, так как известно, что в растворах с низкой ионной силой белки подвергзются микроденатурации, а ферменты быстро теряет свою энзимную активность, Данная последовательность операций обеспечивает довольно хороший выход ТБГ(около 20), причем чистота препарата составляет 95-96%.Сущность изобретения поясняется следующими примерами.Пример 1. К 100 млсыворотки ретроплацентарной крови, содержащей 8 мг ТБГ добавляют сульфат аммония в количестве 30 г(до 50 насыщения) смесь инкубируют при перемешивании 1 час и далее цент рифугируат 45 минут при 6000 об/мин, полученный осадок суспендируют в минимальном количестве воды, дистиллирОванной (получается 20 мл) и наносят .на колонку с сефадексом Г(колонка 5 х 100 см), выделяя при гельфильтрации около 90 мл фракции с максимальной концентрацией ТБГ(около 80 мг/л), Гельфильтрацию проводили в 0,02 м аммоний-ацетатном бУФеРе, Поуенную 4 фракцию, содержащую ТБГ подвергали ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- целлюлозе в том же буфере, осуществляя злюциа 0,2 М хлоридом натрия,-после отмывки от балластных белков 0,06 М хлоридом натрия. Получали около 20 мл элюата с концентрацией белка около 320 мг/л, Этот элюат беэ всякой обработки подвергают афФинной хроматографии на сефарозе и иммобилизованным цибакроном синим, Отмывку проводят 0,2 М хлоридом натрия, а элюцию 55 2,0 М хлоридом натрия. Полученный элюат 5 мл с концентрацией ТБГ около 640 мг/л подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом Гв 0.1 м аммоний-бика рбонатном буфере РН 8,0, выделяя фракцию белков с молекулярной массой 120000 дальтон. При выделении узкого пика 22 мл.с концентрацией ТБГ около 80 мг/л, получали препарат ТБГ чистотой около 957 ь. После лиофилизации было получено 2 мг белого белкового порошка ТБГ. Если учесть концентрацию белка 80 мг/л х 22 мл получено 1,76 мг ТБГ (выход целевого продукта около 22%), то есть в препарате присутствует не более 12 солей, оставшихся в результате не полного обессоливания при гельфильтрации. Это можно считать незначительными примесями, так как даже многосуточный диализ не мажет обеспечить полноту обессоливания.П ри м е р 2. 50 г осадка Ав. содержащего 32 мг ТБГ растворяют в 450 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 6000 об/мин 30 минут, надосадочную жидкость отделяют и добавляют к ней сульфат аммония из расчета 300 г на 1 л(20% насыщения). тщательно перемешивают и через час центрифугируют при тех же условиях, Осадок растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды(получается около 21- 22 мл раствора или суспензии) и наносят на колонку с сефадексом Г, проводя гель- фильтрацию в тех же условиях, что и в примере 1, Получали 90 мл фракции с содержанием ТБГ около 320 мг/л. Эту фракцию подвергают ионообменной хроматографии в условиях аналогичных примеру 1, Получают около 20 мл элюата сконцентрацией белка - ТБГ около 1280 мг/л, который после очистки с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном цибакрон синем красителе при условиях аналогичных примеру 1, дал фракцию в количестве 5 мл с содержанием ТБГ 2560 мг/л. В результате гельфильтрации этой фракции при тех же условиях, что и в примере 1, получали 20 мл раствора с концентрацией ТБГ около 400 мг/л, После лиофилизации получали 8 мг препарата ТБГ, практически без солей. Чистота препарата выше 96 . Выход около 25П р и м е р 3, 50 г осадка Ав обрабатывают полностью аналогично примеру 2. Только аффинную хроматографию проводят на фирменной "Голубой сефарозе", в результате чего получают 5 мл элюата с содержанием ТБГ около 2000 мг/л, из которого после гель- фильтрации протекавшей в тех же условиях, что в примерах 1 и 2, получено 22,5 мл препарата ТБГ с содержанием 320 мг/л. После лиофилизации получено 7,2 мг препарата ТБГ практически не содержащего солей. Следовательно, выход ТБГ около 22,5 , Чистота препарата выше 96/.1836957 кой чистоты препарата, но и относительнохорошего его выхода по целевому продукту(22-25 оь) в мягких условиях за одни сутки. Составитель А.ТерентьевТехред М,Моргентал Корректор Л,филь Редактор С.Кулакова Заказ 2849 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035., Москва, Ж, Раушская нэб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Контроль за чистотой препарата осуществлялся иммунохимически и с помощьюзлектрофореза в полиакриламидном геле.Количественное определение ТБГ производили иммуннохимически, 5Таким образом, предложенный способполучения ТБГ имеет определенные преимущества перед известным, что связаноглавным образом с сокращением временина выделение препарата, отсутствием в процедуре выделения диализа против низкоионных растворов, что должноспособствовать максимальному сохранению нативности препарата ТБГ, что можетиграть важную роль при выделении ТБГ с 15дальнейшим использованием его как биологически активного вещества. Кроме того,разработка различных значительно отличающихся между собой способов выделенияТБГ позволит при промышленном внедрении способов уменьшить зависимость производителя от наличия тех или иныхреактивов,Сочетание традиционных методов препаративной белковой химии высэливание, 25гельфильтрация, ионообменная хроматография) с аффинной хроматографией на иммобилизованном цибакрон-синемкрасителе с заключительным этапом гельфильтрэции на сефадексе Гв летучем 30буфере позволило добиться не только высоФормула изобретения Способ получения трофобластического бета 1-гликопротеина путем обработки сыворотки ретроплацентарной крови или осадка Ав, полученного при производстве гамма- глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови. сульфатом аммония, хроматографии и лиофилизации, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени процедуры, после обработки сульфатом аммония осадок последовательно подвергают гельфильтрации на сефадексе Гв 0,02 М аммоний-ацетатном буфере, фракции, содержащие целевой продукт, подвергают ионообменной хроматографии нэ ДЕАЕ-целлюлозе в том же буфере, отмывку от балластных белков проводят 0,06 М хлоридом натрия ицелевой продукт злюируют 0,2 М раствором хлорида натрия, затем подвергают его аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным цибакрон-синим красителем, отмывают от балластных белков 0,2 М и злюируют 2;0 М раствором хлорида натрия, злюат подвергают гельфильтрации на сефадексе Гв аммоний-бикарбонатном буфере 0,1 М, рН 8,0.