Способ определения апопротеина а-1 в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1 ТЗТ 34 О 0 01 М 33/53 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ротки крови иметилсуль(21) 4839162/14(71) Институт биохимии СО АМН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПРОТЕИНА АВ СЫВОРОТКЕ КРОВИ Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимическим способам определения апопротеинов в сыворотке крови, Предложенный способ может найти применение в клинической диагностике и экспериментальных исследованиях биологических сред,Известен способ определения апо-А, при котором сыворотку крови обрабатывают тетраметилмочевиной при соотношении проба - реагент 1:1 с последующей постановкой твердофазного иммуноферментного анализа.Однако добавление к сыворотке крови тетраметилмочевины приводит к необратимой денатурации апо-В, что не позволяет данные образцы одновременно использовать для определени апо-В, Это, в свою очередь, усложняет препаративную технику и требует дополнительного расхода времени и реактивов.Целью изобретения является одновременное с апопротеином Аопределение апо-В в той же пробе, а также повышение экономичности способа.П р и м е р. Одну часть сывосмешивают с одной частью д(57) Применение; в клинической диагностике и экспериментальных исследованиях биологических сред (моча, спинномозговая жидкость), Сущность: пробу сыворотки крови подвергают химической обработке диметилсульфоксидом, в результате чего выявляются скрытые антигенные детерминанты апопротеина Аи апо-В, а затем в одних и тех же разведениях с помощью твердофазного иммуноферментного анализа определяется содержание апопротеинов Аи В,фоксида, Раствор выдерживают в течение 1 а ч при комнатной температуре. После этого готовят рабочие разведения (1:2000 - 1;5000) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,15 М КаС. Обработанные таким способом пробы вносят в ячейки полистироловых планшетов по 100 мкл, В качестве стандартов наносят по 100 мкл растворов апо-Аи апо-В, содержащих - й 1,2,5,10, 20,50,100 мг белка в 0,01 М фосфатно.-солевом буфере(ФСБ). После инкуба- ( ) ции планшеты трижды отмывают в ФСБ, содержащем 0,05% Таееп - 20 (ФСБТ). Незанятые места сорбции блокируют 10%-ной бычьей сывороткой. В подготовленные таким образом планшеты добавляют по 100 икл специфических антител в разведении 1 : 3000 в 0,01 М ФСБТ. Связавшиеся с апопротеинами первые антитела на следующем этапе насыщают вторыми антителами. Для этого используют козьи антитела против 90 кролика, меченые пероксидозой (Ядща, ОБА), которые добавляют в количестве 100 мкл в каждую ячейку (разведение 1: 1000 в ФСБТ). Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37 С, После 5-кратного отмывания ФСБТ проводят ферментативную реакцию.1737340 25 30 35 40 45 50 Составитель В.БрусиловскаяТехред М,Моргентал Корректор Л.Бескид Редактор М.Циткина Заказ 1887 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 В ячейки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстрата о-фенилендиамина (МегК, ФРГ) в концентрации 20 мг/100 мл в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 0,5, содержащем 0,006 Н 202, Через 15 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10 М Н 2304 и измеряют экстинцию при длине волны 492 нм на многоканальном фотометре "Мобзсап" (Англия). В качестве отрицательного контроля принимают значение оптической плотности в ячейках, в которые вместо антигена добавляют по 100 мкл ФСБ.При обработке сыворотки крови человека ДМСО выявление апо-В не отличалось от контрольного,Проведенное данным методом определение содержания апо-Ав крови равнялось 1,05 .ф. 0,01 г/л, Содержание апо-В составило 0,83 0,01 г/л, Коэффициент апо- В/апо-Аравнялся 0,8. Полученные данные соответствуют литературным. В качестве стандартов использовалась сыворотка с известным содержанием апо-Аи В(СоЬоспев, США).Предлагаемый способ, расширяя арсенал способов определения апопротеинов,5 позволяет определить апо-Аи апо-В в одних и тех же пробах сыворотки крови и ихразведениях, что упрощает препаративнуютехнику этих апопротеинов, При этом способ характеризуется высокой эффективно 10 стью, дешевизной используемого реактива,меньшей его токсичностью для персонала,проводящего определения,Формула изобретения 15 Способ определения апопротеина Авсыворотке крови, включающий обработку пробы реагентом при соотношении его к пробе 1: 1 и последующий твердофазный иммуноферментный анализ, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью одновременного определения а по-В в той же пробе при повышении экономичности анализа, в качестве реагента используют диметилсульфоксид,