Способ получения антигенно измененных вируса гриппа

Союз Советских СоциалистическихРеслублкк ,ОЛ ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оц 661018 61) Дополнит ное к авт. свид(22) Заявлено 22.02.73 (21) 1897261/28-13 л. 2 К 7/О с присоединен (23) ПриоритеОпублик заявки-Государственный начтет СССР па делам нзобретеннй н открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННО ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИППА2 Изобретение относится к области цины и касается вирусологии.Известен способ получения антиген мененных вариантов вируса гриппа введения в куриный эмбрион иммунн воротки к вирусу гриппа и вируса г с последующей инкубацией и выдел целевого продукта (1. ед но изпутем ой сырипйа ением днако такой способповышение иммуноге зменения свойств у ируса гриппа. е позволяет вызности и стабильразличных штам О вать ные мов являетсяств вируДля этого кур тельно пассивно и иммунной сыворо русов гриппа и з дят вирус грипп дозе 10 - 10 ЭИ ционных доз) . Способ осуще зом.1 предвариизологичной одтипам ви час ввоа вводят в ных инфекиные эм ммунизи ткой по тем черВирус Д (эмбр брион руют сем п з 24 - грипп ионал твляют следующим обраЦелью настоящего изобретен стабилизация иммуногенных св са гриппа. Изологические иммунные сыворотки вводят в эмбрион в определенные сроки (не менее чем за 24 час до введения вируса).Этот прием обеспечивает равномерное распределение антител в жидкостях и на поверхности чувствительных клеток куриного эмбриона, в силу чего антитела могут воздействовать на вирус не только в фазе адсорбции и прикрепления к поверхности клеток, но и в фазе выхода вирионов из них. Этот прием предотвращает проявление феномена разведения. Для введения в эмбрион используется смесь иммунных изологических сывороток к представителям всех подтипов вируса, циркулировавших до выделения направленно изменяемого штамма.Цель этого приема - предотвратить реверсию свойств вариантов в сторону штаммов-предшественников и направить изменение свойств по пути, близкому естественному процессу изменчивости. Вирус, который подвергается направленному воздействию, вводится в пассивно иммунизированный эмбрион неразведенным, т.е. в систему вносится 10 - 10 ЭИД.Этот прием позволяет вводить в пассивно иммунизированные эмбрионы весь наборчастиц, из которых под влиянием антител сохраняют свою активность наиболее жизнеспособные или атипичные по сравнению с основной массой варионов исходной популяции. 5Контроль дозы сыворотки в пассивно иммунизирс(ванном эмбрионе осуществляется: по уровню антигемагглютининов в жидкостях эмбриона непосредственно перед введением вируса; по силе их нейтрализующего воздействия в пассивно иммунизированном эмбрионе через 48 - 72 час после введения вируса.Изменение свойств вируса (повышение или понижение его иммуногенности) регулируется количеством введенной в эмбрион 15 сыворотки, которое контролируется по вышеуказанному методу, а тдк)ке кратностью воздействия иммунными сыворотками.Пример. 1. Отбор штаммов вируса и получение изологических иммунных сывороток.20Изологические иммуцц(е сыворотки (петушиные) готовят по методу 8 пе 1 е к изменяемому Вирусу и и р дста Вителям вирусов-предшественников. Например, если изменяемым вирусом является штамм Л 2 Гонконг 1)68, то почимо этс(0 вируса для иммунизации петухов используют предшественники: АО (свиней), ЛО (Шкл), Л (Пан, Скандинавия), А 2 (Сингапур, Одесса, 1 енигнад) или другие, бл:(зкие им цо свойствам штаммы.11. Пассивная ичмуциза(,ия куриных эчбрионов 9 в 1 О дневого срока ицкубации. Выбор и контроль дозы и 1)(уцных сывороток в эмбрионе.Концентрация антител в жидкостях эмбриона должна приближаться к фоновому уровню антигемагглютццицов к вирусам-прел шественникам в сыворотках крови люд 1.При этом, однако, эмориональцые жидкости должны содержать антитела в титре не менее 1:10.Заданную концентрацию антител в пассивно иммунизирова.п(ых эморионах получают при введении количества сыворотки, которое определяют путем предварительных расчетов, искдя 1(з титра сывороток и усредненного веса эмбриональной жидкое ти и эмбриона с оболочками. Правильность расчетов контролируется определением уровня антигемагглюти 15(цов в жидкостях эмбрионов через 24- 48 час после пассивной иммунизации и 1;ыращивания в термостате.Например, для того, -тобы в жидкостях эмбрионов антигемагглю.инины содержались В пределах титров 1 101:20, в каждый эмб.рион вводят по 0,16 мл изологической сыворотки с титром специфических антигемагглютининов 1:1280. Через 24 - 48 час инкубации и последуощео охлаждения титры антител в жидкостях при контрольном определении в реакции торможения гемагглютинации (РТГЛ) составляют от 1:8 - 1:6. Заданная концентрация антигемагглютининов в жидкостях эмбриона является исходной. Поскольку было установлено, что концентрация сыворотки в пассивно иммунизированном эмбрионе определяет свойства селекционируемых вирусов, то последующие этапы работы предусматривают контроль ее содержания не только по уровню ацтигемагглютининов в жидкостях эмбрионов, но и цо силе их цейтрализующего воздействия ца вирус..),Ля того, чтобы осуществить указанные коцтроли, отбирают количество сывороток, необходимое для пассивной иммунизации 20 эмбрионов. Сыворотки смешивают. В каждый из 10 эчбрионов вводят 1,20 часть приготовленной смеси. Оставшук)ся смесь сыВороток рдзво;1 ят изотоцическим раствором (Коваренюй соли с коэффициентом 2 до титра ц) кц(чцочу разведению в эмбриональной ки;(кости (перед заражением, т.е. неразведенцд 51 э)(бриоцалы(353 жидкость ИОсле 24 - 48 ч) 1(ссиццо ич)1 ц;(зирванных э(бриоцов должцд трчозпь 4 гемагглютицирующце единицы ГЛ 1. изменяемого вируса). Каждым рдз)едеци.м счеси сывороток ц 1 сси 13 ИО имм) цизир,(ОГ по 10 э.101)ионОВ.Через 24 или 48 чдс цо 5 эморионов, которыч оыли Введены различные разведения сьВороток, Вскрыцдк)т. и В РТГЛ с жидкостью кдкдого эмориоца Определяют содержание дцтиечагглютицицов к измецяемому вирс у и В 1 рс 3 м - ц р д( е с т В . и ц и к я )1. /К и д к 0 с - тц контролируют ) акже на стерильность.111. Заражение пассивно иччуцизированцых куриных эморишов. Оцрсде.(ение режимов ссгСкци В соот)етствии с за,(ачачи исСЛЕД 0131 ЦИЙ.Оставшиеся эчориоцы (цо 5 эчбрионов, пдссивцо иччуцизировдццых церазведецны)(и сывороткачи ц сыворотками В разведениях) заражают 0,2 чл цельной Вируссодер)к 11 це 1 жиг 1 кости измсц 5 е)10 ГО Вирх са ( В каж- ;1 ыИ ЭГ(брио( ВВО,351 Т 2.10 2.0" Э)(брпОцальцых ицф кццоццых доз )И,. измен 51 . ч 0 г О В и рс а ) .Заражеццые пассивно иммунизированные эмбрионы через 48 72 ас ицкубации при 35 - 36 С ох)аж;3 ак) х вскрывают и неслед) ют В реакции гема глютинапии (РГЛ) свзвеськ эритроцитов кур. Контролирукт ца бактсриаль(ую стерильность.я Из лишенных бакзагрязнеция жидкостей пассивно иммунизированных зараженных эмбрионов готовят смеси (смесь состоит из жидкостей эмбрионов, пассивно иммунизированных каждым разведением сывороток) .Смеси эмбриональных жидкостей, соотВетствующие разведениям сывороток, контролируот на содержание вируса методом предельных разведений. При отсутствии инфекционной активности неразведенного материала его пассируют трехкратно на куриных эчбрионах неразведенным.; ахал 2300125 тираж 525 Подяисное ЦН 11 И П И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Рву шская наб д, 4(5 Филиал П ПП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Последующие воздействия сыворотками на изменяемый вирус проводят, исходя из задач исследований.Получение вариантов.В случае необходимости получения на конечных этапах вариантов со сниженной иммуногенностью и изменившимися антигенными взаимоотноц(ениями, для последующих воздействий применяют концентрации сывороток, которые снижают инфекционность изменяемого вируса в пассивно иммунизированных эмбрионах в сравнении с вирусом, пассированным в нормальных эмбрионах, в 1 О - 10 раз, т.е. при последующем пассировании на куриных эмбрионах материала из зараженных пассивно иммунизированных эмбрионов вирус удается выявить в следующих случаях: а) остаточная инфекционность проявляется при разве.1 ении жидкости в 10 раз; б) вирус удается выявить в неразведенной жидкости пассивно иммунизированного заре(женнсго эмбриона; в) инфекционность вируса проявляется на 2 - 3 пассаже в курином эмбрионе. (Г 1 ервый тип воздействий).В слу.(ае необходимости получения вариантов вируса с повышенной иммуногенностью, высокой реро.1 уктивной и гемагглю. тинирующси активностью, стимулирующих (ри иммуниза(1 ии образование антител с оо.(Ое широким спектром реагирования, че д 1 исходный виру, для последующих воздейс; вий пр 1(меня(от кон(1 ентрации сывороток, которые снижают инфекционную активность измеииемсио вируса в пассивно иммунизирозаном эмбрионе в 10 - 10 раз. (Второй (ип возсйствий(. После одно(о пассажа на куриных эмбрионах вирусы, подвергшиеся воздействиям КаК ПО ПЕРВОМУ, таК И ПО ВтОРОх(У ТИПУ, ВОС- станавливакгг инфекционную и гемагглютинирукщую акгивносгь, при этом инфекционная активность 1(ри последуюц 1 их пассажах становится более высокой, чем у исходного вируса.После;(ассажа на куриных эмбрионах вирусы подвергают повторному воздействию сыворо(кам( в пассивно иммунизированных эмбрионах со (тветственно по пеовому и второму ти(1.П 1 Ое)эя(о( инфекционную активность вируса 1(осле в.О( Ого воздействия В 11 ассивО имм,низи(1 О 1(ном к пи:(Ом э(бгч(о.(е. При воздействиях по первому типув случае повышения остаточно: инфекционной активности для куриных эмбрионов изменяемого вируса после второго пассажа 5 более чем в 10 раз, дозу иммунных сывороток, вводимых в эмбрион, увеличивают до подавляю 1(,ей инфекционную активность в 10." - 10 раз.По второму типу - воздействия проводятустановленной первоначально дозой, 10Своиства полученных вариантов проверяют с;(омощью общепринятых методов.Количество воздействий иммуннь(ми сыворотками в пассивно иммунизированных эмбрионах проводят в соответствии с поставленной задачей.Повышение иммуногенности происходитпосле 1-го - 3-х воздействий как по первому, так и по второму типу. Последующие воздействия по пер 1(свау типу резко снижают иммуногенность вируса (по антителоб разованию в течение 2 - 3 недель после иммунизации). При этом снижается также авидность вируса и изменяются его антигенные взаимоотноц(ения с исходным вирусом и родственными вариантами.25Второй тип воздействий, помимо повышения иммуногенности, вызывает стойкое повын(ение репродуктивной и гемагглютинирую(цей активности популяции вируса и вызывает образование антител с более широким спектром реагирования в РТГА.30. Способ получения антигенно измененных вариантов вируса гриппа путем введения в куриный эмбрион иммунной сыворотки к вирусу гриппа и вируса гриппа с последующей инкубацией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью стабилизации их(мх ногенных свойств вирмса гриппа, куриные эмбрионы предварительно пассивно иммунизируют изологичной иммунной сывороткой по всем подтипам вирусов гриппа и затем через 24 в 48 час вводятвипус гриппа.2. Способ по и. . отличающийся тем,что вирус гриппа вводят в дозе 10 в - 1 О Э 1(ДИсточики инфоп(ации, принятые во внимание при экспертизе1. Ж,ЧЭИ, 10, 1954, с. 44.