Способ получения липидов, содержащих -линоленовую кислоту

(9) 751212 А.3 ОСУДДРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛ ЬСТВ(71) Институт микробиологии АН СССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1585331, кл. С 12 Р 7/64, 1988,(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу физиологически активных веществ, в частностилипидов, содержащих у-линоленовую кисИзобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу физиологически активных веществ,Известен способ получения липидов, содержащих у-линоленовую кислоту, путем выращивания гриба Мцсог цзИапсцз ИНМИ. ВКМ Г:) на среде следующего состава, г/л: глюкоза 30; мочевина 1; К 2 НРО 41; ЙаС 0,5; М 9 Я 04 7 Н 20 0,5; Ге 2 Я 04 7 Н 20 0,01; СаС 12 0,02; ЕпЯ 04 7 Н 20 0,01; дрожжевой экстракт 0;5; витамин Вб 0,002; биотин 0,02 мг;при 20-300, рН 4,5-6,5 в течение трех суток при аэрации 1,8 02/л/ч. Получают липиды, содержащие 29-32 фб улиноленовой кислоты от суммы жирных кислот, На 100 л использованной глюкозы получают 2,77 г у-линоленовой кислоты. Недостатком этого способа является недостаточно высокое содержание у-линоленовой , кислоты в липидах.Цель изобретения - увеличение содержания у-линоленовой кислоты в липидах.(55 С 12 Р 7/64, С 12 М 1/14 // //(С 12 14 1/14, С 12 В 1;785 2лоту, Целью изобретения является увеличе: ние содержания у-линолейовой кислоты в липидах, Это достигается путем выращивания гриба Мцсог цз 11 ап 1 сцз ВКМР 306-Д при глубинном культивировании в условиях непрерывной аэрации на питательной среде, содержащей углеводородный источник углерода и неорганический источник азота; среда"дополнительно содержйт солодовый экстракт в количестве 0,05 - 0,1 г/л, источник азота подают дробно по схеме: 50;4 при посеве, 25-500, в конце первых суток, остальное в конце вторых суток. В течение трех суток на 100 г использованного источника углерода синтезируется до 3,8 г у-ли-, ноленовой кислоты, 2 табл. Указанная цель достигается тем, что гриб Мцсог цзтапсцз ВКМ Гвыращивают на среде следующего-состава; г/л; глюкоза 30-60 г; мочевина 1-2; К 2 НРО 4 1-2; МаС 05+0,01; МЯЯ 04 7 Н 20 0,5+0,01; )-еЯ 04 7 Н 20 0,01-0,02; СаС 12 0,02+0,001; ЕпЯО 47 Н 20 0,01+0,001 МпО. 0,01+0,001; дрожжевой экстракт 0,3 - 0,5; солодовый экстракт 0,05 - 0,1; витамин В 6 0,002; биотин 0,02 мг, при 20 - 30, интенсивности аэрации 1,6-1,8 02/л/ч, рН среды перед посевом 6,3 - 6,8. Выращивание проводят в течение 66 - 72 ч, Концентрацию азота в среде на протяжении выращивания поддерживают в определенном интервале - 0,25 - 0,7 г/л, Для этого азот добавляют дробно - при посеве 500/ мочевины, в конце первых суток 25 - 50, в конце вторых суток - остальное. Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием, Липиды экстрагируют из влажной биомассы смесью хлороформ-метанол-вода = 1:2:0,8, Жйрнокислотный со10 15 20 25 45 50 55 став липидов определяют методом газожидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получаюткислотным метанолизом, В результате получаютлипиды, содержащие 40 - 45% у-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот,П р и м е р 1. Культуру выращивают втечение 72 часов в колбах на 2 л, содержащих 300 мл .среды при 28 С на качалке.Состав среды, г/л:Глюкоза 30Мочевина 1К 2 Н Р 04 11 чаС 0 Г,М 93047 Н 20 . 0,5Ге 304 7 Н 20 О 01с.пЯ 047 Н 20, 0,01 .СаС 2 О 02МпО 001Дрожжевой экстракт 0,3Солодовый экстракт 0,05Витамин Вб 0,002Биотин 0,02 мгМочевину при посеве добавляют в количестве 0,5 г, через 24 ч - 0,5 г на.1 л среды.В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 106 кл/мл. Споровый материал выращивают на пшеничныхотрубях.Биомассу отделяют от культуральнойжидкости, экстрагируют липиды смесьюхлороформ-метанол-вода =1:2,0,8, Полученные липиды содержат 40% у-линоленовойкислоты от суммы жирных кислот. Выходбиомассы на 100 г глюкозь 1 - 36, липидов -10,5 г, сумма жирных кислот - 7,93, из ниху-пиноленовая кислота - 3,21 г.В табл, 1 представлен состав жирныхкислот липидов гриба Мцсогцзтапсцз ИНМИ,П р и м е р 2, Культуру выращивают втечение 66 ч в 2-литровых колбах, содержащих 300 мл среды при 28 С и интенсивностиаэрацйи 1,8 г 0 /л/ч.. Состав среды, г/л:Глюкоза 60Мочевина 2К 2 НР 04 2МаС О 5М 93047 Н 20 0,5Ре 304 7 Н 20 0,02Еп 504 7 Н 20 0,01Дрожжевой экстракт 0,5Солодовый экстракт 0,1Витамин В 6 0,002Биотин 0,02 мгМочевину при посеве добавляют в количестве 1 г, через 27 ч - 0,5 г, через 42 ч - 0,5 г. Биомассу отделяют от культуральной жидкости, липиды экстрагируют как в примере 1, Полученные липиды содержат 45 оу-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот, Выход биомассы на 100 г использованной глюкозы - 36,6 г, липидов - 11,2 г, жирных кислот - 8,4 г, у-линоленовой кислоты - 3,8 г.В табл, 2 представлен состав жирных кислот липидов гриба Мцсог Ьз 1 апсцз ИНМИ,Используя предложенный метод, получают жирные кислоты, содержащие 40450 у-линоленовой кислоты, при этом на 100 г использованного источника углерода получают до 3,80 г у-линоленовой кислоты, в то время как в предложенном ранее способе получают липиды, содержащие 29- 32 % у -линоленовой кислоты от суммы жирных кислот, и на 100 г использованной глюкозы выход у-линоленовой кислоты составляют 2,77 гТаким образом, преимуществом предлагаемого способа получения у -линоленовой кислоты по сравнению с ранее предложенным является повышение выхода у-линоленовой кислоты на 100 г использованного источника углерода в 1,4 раза за счет повышения содержания у -линоленовой кислоты в липидах, Повышение содержания в липидах у -линоленовой кислоты удешевляет получение ее чистого препарата, также повышает ценность липидов как основы для получения лекарственных препаратов. Увеличение выхода целевого продукта достигается путем изменения режимаазотного питания продуцента, Время ферментации сокращается до 66 ч. Формула изобретения Способ получения липидов, содержащих -линоленовую кислоту, путем выращивания гриба Мцсогцзсапсцз ВКМ Гна питательной среде, содержащей мочевину 1-2 г/л, глюкозу - 30-60 г/л, минеральные соли, микроэлементы, дрожжевой экстракт и витамины, при 20 - 30 С, рН 4,5- 6,5, аэрации 1,6-1,8 02 л/ч в течение 2,6-3,0 сут., о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения содержания у-линоленовой кислоты в липидах, процесс ведут на питательной среде, дополнительно содержащей солодовый экстракт в количестве 0,05-0,1 г/л, в мочевину подают дробно по схеме: 50% при посеве, 25-50% в конце первых суток, а при наличии остатка его вводят в конце вторых суток.1751212 Та:блица 1 Табли С 18;з С 18: 16 1 В:г 18:О 18:о 5;0 9 9,2 5,1 Редактор Н.Швыдкая Заказ 2665 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 ные кисоты от сумм жирных кислот Составитель Н.фунтиковаТехред М.Моргентал Корректор С.Пекар