Питательная среда для выделения чумного микроба

(я)5 С 1 ИЯ ОП МУ СВИДЕТЕ К АВТОРСК В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР НИЕ ИЗОБРЕ(71) И ркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока(72) 3. И. Васильева, М, П. Маевский, А. А. Болдина и А, Г, Вылков (56) ТумановскийВ, М., Бахрах Е. Э., Обухова 3.А., Юргина 3. А. Получение сухих пита. тельных сред для диагностйки чумногомикроба. Труды института "Микроб", Саратов, 1958, вый. 2, с. 383-387.Трофименко Н. 3, Разработка и внедрение в практике сухйх питательных Сред для диагностики возбудителей ООИ: Дйсс. канд.биол. наук, Иркутск, 1971, с; 165.Регламент производства М 119-88, Питательная среда для культивирования чумного микроба сухая. Иркутск, 1988, 204 с. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА Изобретение относится к медицинскоймикробиологии и биотехнологии и можетбыть использовано для выделения всех известных подвидов чумного микроба приэпизоотЬлотическом обследовании природных очагов.,),Широко известны питательные средыдля вйделенйя чумнЬго микроба: Туман-ского иагар Хоттингера, содержащие в своем составе питательные основы (мяса,крови, казвина). Эти среды готовят надистлллированной воде с солевыми компонентами, затем кипятят, фильтруют и стерилйзуют,(57) Использование; медицинская микробиология и зпидемиология, а именновыделение всех известных подвидов чумного микроба при зпизоотологическом обследовании природных очагов. Сущность изобретения: питательную среду для выделения чумного микроба, содержащую, г/л: гидролизат казеина 11,0-13,0; гидролизат.кормовых дрожжей 1.1-1,3; фосфорнокислый однозамещейный калий 2;4-2,6; фосфорно- кислый двузамещенный натрий 7,4 - 7,6; молибденовокислый аммоний 0,4-0,6; глюкоза 1,4-1,6; ллмоннокислый натрий 0,9-1,1; танин 0,019 - 0,021: генцианвиолет 0,0024- 0,0026 и агар (порошок) 14,0 - 16,0,. готовят смешением сухих компойентов с применением приема тритурации для введения та-нина и генцианвиолета, Сконструированная у) среда позволяет выделять вСе известные подвиды чумного микроба в В-форме при эпизоотологическом обследовании природ- ф . ных очагов. 3 табл. Известна сухая питательная ср культивирования чумного микроба, зуемая для выделения возбудите при обследовании природных оча держащая ферментативный гидрол зеина, ферментативный гидр кормовых дрожжей, натрий хлорис трий фосфорнокислый двузамещен трий пиросернистокислый (метаби натрия), агар и дистиллированнуюНедостаток известной среды з ется в том, что среда требует добавк .анвиолета ех теароге при иссле эктопаразитов и трупного материа выделении тиаминзависимых штам еда для испольля чумы гов, соизат каолизат тый, наный, насульфит воду.аключаи генцидовании ла, При мов чум1,1 - 1,3 1,4 - 1,6 7;4-7,6 ного микроба в среду после стерилизациидобавляют ех 1 егпроге витамин В 1;Недостатком способа изготовлейия известной среды является то, что среду изсухого порошка изготавливают только в специализированных лабораториях,так какагаровые студни стерилйзуют в автоклавах,разливают в стеклянную тару и дбстааляютдля работы в зпидотряды автотоайсйортом,где расходуют в течение 1 - 3 мес. Хранениеготовой среды в течение 1-3 мес при температуре от 1 до 39 С резко снижает ее качество,Цельюизобретейия является "повышение ростовых свойств среды и ее селективности в отношении й-форм чумногомикроба всехподвидов,Эта цель достйгается тем, чтопйтательная средаДля выделейия чумного микроба,содержащая Иитательнйе"основы Ътар; минеральные солй идистиллированнуюводу,в качестве пйтательных основ содержйтгидролизаты каэеина и кормовых дрожжей,дополййтельно содержит танин; глюкозу,натрий лимоннокйслый и генцианвиолет, вкачестве минеральных солей - калий фосфорнокислый однозамещенный; натрийфосФорнокислый двузамещеййы:й,"аммоний молибденовокислый при следующемколичественном соотношений компонентов, г/л:Гйдралйэат казвина(порошок):11,0 - 13,0Гидролизат кормовых дрожжей (порошок).ГлюкозаНатрий лимоннокислый09 - 1,1Танин 0,019-0;021Калий фосфорно- .кислый однозамещенййй 2;4 - 2,6Натрий фосфорнокислцй двузамещенныйАммоний молибденовокислый . 0,4 - 0,6Агар140 - 160Генцианвиолет 0,0024 в ,0026Дистиллированйаявода . 1 лВ среде, взятой за прототип, ростовыесвойства обеспечивают компоненты, входящие в ферментативные гидролизаты каэеина и дрожжей, которых недостаточно дляроста всех известных подвидов чумногомикроба,В предлагаемой среде сухой гидролизатказеина является питательной основой, су 1,1 1.4 7,4 1,3 1,6 хой гидролизат кормовых дрожжей содержит комплекс витаминов, необходимых дляроста чумногомикроба, глюкоза и натрийлимоннокислый являются источниками уг лерода для построения клетки, калий фосфорнокислый однозамещейный, натрийфосфорнокислыйдвузамещенный и молибденовокислый аммонии являются осмотическими стабйлизаторами, оказывающими 10 буферное действие и поддерживающими нанеобходимом уровне рН среды, танин и кристаллический фиолетовый подавляют йостороннюю микрофлору. Такая рецептурасреды с минимальным,максимальным и 15 средним содержаниемкомпонентов обеспечивает прорастание на среде всех известных подвидов чумного микроба из малых .посевных доз (10 м.к,)втипичной Й-.форме.Г 1 итательную среду готовят смешением 20 сухих компонентов с применением приематритурации дЪя введения танина и генцианвиолета,., .П р и м е р 1. Смешиваютсухие компоненты, г:25 Гидролизат казвина(порошок):,: 11,0Гидролиэат кормовых дрожжей (порошок)30 ГлОкозаНатрий лимойнокислый .: ". .0,9Танин . 0,019Калий фосфорйо 35 кисль 1 й однозамещенный 2,4Натрий фосфорнокислый двуэамещенный:40 Аммоний.молибденовокислый 0,4Агар 14 0Генцйанвиолет 0,0024Полученную навескусреды рас 1 воряют в 1 45 л дистиллированной воды, тщательно размешивают, нагревают на медленном огне дополного расплавления, кипятят 3-5 мин, ох- .лаждают до 45-50 ОС, Готовую среду разливают в стерильйые чашки Петри.50 П р им е р 2; Для приготовления 1 лпитательной среды смешивают сухие компоненты, г;Гидролизат казеина(порошок) 13,0 55 Гидролиэат кормовых дрожжей (порошок)ГлюкозаНатрий лимоннокислый 1,12,6 1,2 1,5 2,5 Танин 0,021Калий фосфорнокислый однозамещенныйНатрий фосфорнокислый двузамещенный . 7,6Аммоний молибденовакислый 0,6Агар 16,0Ген циан виолет 0,0026. Натрий фосфорнокислый двузамещенный . 7,5Аммоний молибденовокислый 0,5Агар 15,0Генцианвиолет 00025Среду готовят, как в примере 1.Ростовые свойства предлагаемой среды с минимальным, максимальными средним количеством компонентов оценивают йутем посева 10- и 100 микробных клеток двухсуточной агаровой культуры возбудителя чумы разных подвидов, а также посева органов животных, зараженных вирулентными штаммами чумного микроба и суспензий инфицированных блох, через 24 - 48 ч инкубации при 28 С, В качестве контрольных сред используют среду Туманского и казеиново-дрожжевой питательный агар для культивирования чумного микроба.На предлагаемой среде и контрольных средах испытаны штаммы чумного микроба:ЕВ, И, выделенный в Горно-Алтайскомприродном очаге и Р, выделенный в Армянском нагорном очаге, Для инфицирования биопробных животных и блох использованы штаммы; И, выделенный в Тувинском природном очаге, И, выде ленный в Сайлюгемском очаге и И, выделенный в Северо-западной частиМонгольского Алтая.Результаты раста чумного микроба напредлагаемой среде приведены в табл. 1 и 2, из которых следует, что предлагаемая среда обладает достаточной чувствительностью, количество, выросших клеток на предлагаемой и контрольной средах одинаково.5 Однако на предлагаемой среде морфологияколоний типичная в Я-форме с кружевной зоной и бугристым центром для штаммс чумнсга микроба из Забайкальского, Тувинского, Горно-Алтайского и Закавказского 10 природных очагов, в то время как на контрольной среде морфология колоний чумного микроба атипичная (кружевная эона отсутствует; колонйи плоские), и рост штаммов Закавказского очага чумы отсутствует.15 Бактериологическиеисследование органов павших животных и суспензий блох (табл, 3), инфицированных вирулентными штаммами чумного микроба, свидетельствует о том, что на предлагаемой среде через 20 24 ч инкубации при 28 С формируются колонии, имеющие все иризнаки, типичные для чумного микроба. Среду можно применять для исследования полевого материала при эпизоотологическом обследовании разпич ных природных очагов чумы, в то время какпри использовании прототипа невозможно выделйть чумной микроб в Закавказском нагорном очаге (табл, 2).Проведено испытание предлагае мой среды в полевых условиях: МНР, вЗабайкальском, Тувинском природных очагах.Исследовано 2116 грызунов и млекапитающйх, 19610 эктопаразитов, при этом выделено 47 штаммов чумного микроба.35 Предлагаемая среда стандартна, ненуждается в фильтрации, стерилизации; добавке ех сетроге витамина В 1, генцианвиолета, и поэтому в отличие от прототипа среду можно готовить в неспециалиэиро вайных лабораториях полевых формирований. Приготовление среды способом смешения сухих компонентов позволяет сократитьдлительность технологического цикла в сравнении с прототипом на 40 ч.45Формула изобретения Питательная среда для выделения чумного мйкроба, содержащая ферментативный гидролизат казеина; ферментативный 50 гидролизат кормовых дрожжей, фосфорнокИслый однозамещенный калий, фосфорно- кислый двузамещенный натрий, стимулятор роста, агар и дистиллированную воду, о ти и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повыше ния ростовых свойств среды и ее селектив-.ности в отношении Б-форм чумного микроба всех подвидов, она дополнйтельно содержит глюкозу, лимоннокиспый натрий, танин, генцианвиалет, в качестве стимулятора раста - малибденовокислый эммоний при сле1751211 ТанинОднозамещенныйфосфорнокислыйкалий,Фосфорнокислыйдвузамещенный натрийМолибдюеновокислыйаммоний.ГенцианвиолетАгардистиллированнюэявода 0,019 - 0,021 2,4-2,6 11-13 7,4-7;6 1,1-1,3 1,4-1,6 0,4-0,60,0024-0.002614-16 10 0,9-1,1 1 л Таблица 1 Результата роста чумного микроба на предлагаемой средес минималюьнйм,максимальнцм .и средним колицеством компонентов матнаевюиеиаеаюювюавамввиаамййаеюаеаатюеаайаавююйищ в союдюеераащая келйцество компонентоюва Контрольная .средаВ еегав еююге е и е ю в и е е а в ае а а ав в Ю а в Номер щтаммов Предлагаемая среда, авеаеевмююайюеейюююаюи вметавмамаевемаеаейюеееаааеюмввеМорфоло"гия колонийю е г а в ю е ае ю ю Ев ею а е ав и Минимальное Максимальное Среднее" Чувстви"тельность в и в и е щюЮ юе е а в е а ав авювеееевава вививеа Морфоло- Чувствигия ко- тель" лоний ностье г а Ее ев амав Морфоло" Чувствигия коло" тель" ний . ность Морфоло"гия колоний Чувстви"тельеность 1.ревс 1 з ЕО Типичная 9(вакцинный)1.резс 1 з 1994 Типицйая 9 аиваее и В а ею и щВ и и юв е ю игееаеавиг маа вета и ееввв тюаеаюееа вее авамтю и в евам Типичная 9 Атипич 9ная Типичная 9Тйпичнаюя 9 1 тйпицная 9 Типичная 9Тийицная 9Типичная 1,рввОе 1995 Типицнвя 9 Типичная 9 Т,реваз 3278 Типичная 8 Типичная 9 1.резс 1 з 2359 Типичная 8 Типичная 9 Типичная 9 Типичная 9 1.резаке 3202 Типичная 9 Типичная 9 Типицнал 9 Типичная 9 1,ревсХз 3181 Типичная 8 1.резсъз 95 Типичная 8 1,рюевЫв 227 Типичная 8 Типичная 9 Типичная 9 Типичная 9 Типичная 9 Типичная 9 Типичная 8 . тйпицная.9 типичная 8 Типичная 8 Типичная 8 Типичная 8 Типичная 9 Типичная 8 Типичная 8 гаееаиейаваеавввиеетатвюевюеввемавагиавваа ивеаеевевювюмващееве дующем количественном соотношении компонентов, г/л: Ферментативныйгидролизат казеи на(по сухой массе)Ферментативныйгидролизэт кормо-.вых дрожжей (по су- .хой массе)ГлюкозаЛимоннокислыйнатрий 1,ревс 1 з 3277 Типицная 8 : Типичная 9 1.резйз 1680 Типичная 9 .1ревс 1 з 2677 Типичная 8 1,резерв 3161 Типичная 91.резс 1 в 3162 Типичная . 8 1.резс 1 в 3163 Типицйая 7 1.резаке 3164 Типичная 8 1,ревЯз 3165 Типичяая 8 1.резф 1 з 3166 Типичная 8 1.резс 1 з 1823 Типичная 8 1.резсЫ 1822 Типичная 8 Типичная 9 Типичная 8 Типичная 9 Типичная 9 Типичная 8 Типичная 8 Типичная 8Типичная 9 Типичная 9 Типичная 9 Атипйц-" 9 ная Атйпич" 9 ная Атипиц" 9 наяАтипицнаяАтипич" 8наяАтипицнаяАтипич" 9наяАтипицй 8Япич" 9ная Роста нетРоста нет Роста нет" Роса нетРоста нет Роста. нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста йет вава йею еА маваава е ее вюзи9 1751211 10Таблица 2Результаты роста штаммов чумного микроба,выделенных из различных очагов чумы напредлагаемой среде и контрольной Наименованиае природного очагам аююа в м В м а аю а м м в м м аюю ею мм м м аю м аю е аю ею м а юю м аа аю ею м Средйее .число выросшихколоний -из 100 м.к.(5 определеений) Номерштаммовчумногомикроба в е м еюа м ее ею м е аа м м м ее Йа предла- .На контрольгаемой :,". ной средесредеааюювеюаееюаюююмаюмеюаюаюаа мав м 4 вва ммммммавв Забайкальский :": 1994 . 92 а :; 87: .:. ::, 3165 "; 60 -, Роста нет 3166. 62: -Роста нет 1823 65: :; Роста нета ае ае аю ае ею ею ае ее аФ м ае аае аею ею аю аю м ае м М а мм а аю а аа ею юа еа ае аее аа ею ее м м м еа еа Таблица 3 Результаты бактериологическогоиспытания предлагаемой средюыю-в полюеавыхусловияюх вагарина, 10 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Уж аказ 2665 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб;, 4/5