Способ определения амфотерицина в в крови

(57) Использование исследования.амфо рощение способа, мичности, Сущнос рови смешивают трихлоруксусной ки инкубируют в темно +5 С с последующи ем. Пол ожител ьн ый упрощение способа нститут им С.В.Сандер в, А.В.Ильченко88,8)РоаП 1 М, а1985, 337, М 2ПРЕДЕЛЕНИЯ а. 1; Спгот,р. 423-428.АМФОТЕРИ- . едицине,ам исследоно для колите и ина ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ Изобретение относится к м а именно к биохимическим методвания, и может быть использовачественного определения амфо р ц В в крови.Известен ряд способов количественного определения амфотерицина В: микробиологический, хроматографический и спектрофотометрический.Однако, микробиологический способ обладает низкой чувствительностью (не выше 5 мкг/мл), требует для своего проведения большого количества высокочистых реактивов, специального микробиологического оборудования, высокой квалификации исполнителя и длятся до 2 сут, т.е. метод практически неприменим для серийных экспрессных биохимических исследований в условиях клиники, где требуется проводить контроль содеркания препарата в крови в кратчайшие сроки с целью своевременной корректировки вводимых доз.Для определения амфотерицина В используется высокоэффективнаяжидкостная хроматография на приборе с патроном "Яаб-Рак С100 х 8 мм с УФ-детектором с биохимические методы терицина В, Цель - упповышение его эконоь изобретения: пробу с 10%-ным раствором лоты, центрифугируют, те 2 ч при температуре м флуориметрированиэффект: удешевление, 5 табл,фильтрами 405 и 340. нм. Отношение поглощения при 405 и 340 нм используется для оценки содержания примесей,Для определения пробу крови 500 мкл выдерживают 30 мин до ее свертывания, затем пробу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин с целью отделения сыворотки. 100 мкл сыворотки смешивают с 300 мкл подвижной фазы (смесь метанола с 5 мМ раствором ЭДТА с рН 7,8 в соотношении 80:20) и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Отбирается 100 мкл супернатанта, которые и подвергаются анализу в ВЭЖХ-хроматографе.Чувствительность метода 0,05 мкг/мл, калибровочный график линии до 1,4 мкг/мл, степень открытия амфотерицина В в сыворотке 80. При концентрации препарата 1.55 мкгl мл коэффициент вариации определения составляет 3% (при и = 10),Недостатком метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в данном случае является то, что для его осуществления необходим ВЭЖ-хроматограф - прибор ограниченной доступности, т,е, осуществить определение амфотерицина В методомВЭЖХ в клинических условиях практически Из табл, 1 следует, что для достиженияневозможно. Кроме этого, этот метод требу- наибольшей чувствительности метода и поет использования особо чистых реактивов и стоянства результатов необходимо выдерматериалов, для работы на хроматографе жать смесь в течение 2-3 ч,необходимо иметь подготовленного специ Была определена зависимость флуоресалиста.ценции от условий инкубирования (освеЦелью изобретения является упроще- щенность,температура),ние способа и повышение его экономично- Раствор амфотерицина В с концентрасти, цией 3 мкг/мл приливают к 10-ному расПоставленная цель остигается путем 10 твору ТХУ, причем было взято четыре серииопределения флуоресценции амфотерици- пробирок по восемь штук в каждой серии,на В в среде трихлоруксусной кислоты Условия инкубирования: все серии инкубировали в течение 2 ч, Серия 1 - полная темоСпособ осуществляется следующим об- нота, температура 5 С, серия 2 - полнаяразом. 15 темнота, температура 20 С, серия 3 - полК пробе, содержащей амфотерицин В, ная темнота, температура 50 С и серияприбавляютрастворТХУ,центрифугируюти при солнечном, освещении, температурапосле инкубирования определяют флуорес С,ценцию данного раствора, После инкубирования производят заП р и м е р, Реактивы:. раствор ТХУ в 20 мер флуоресценции, Усредненные значениядистиллированной воде 10 ф . Ход определе- показаний измерительного прибора по каждой серии приведены в табл. 2.К 1 ч. плазмы крови (0,5 мл) добавляют Очевидно, что оптимальным условием10 ч, (5 мл) раствора ТХУ, Пробу интенсивно для повышения чувствительности методавстряхивают в пробирке в течение 15 с, за является инкубация смеси в темноте притем содержимое центрифугируют 10 мин пониженной температуре. Воздействиесвепри 3000 об/мин. Надосадочную жидкость та на инкубируемую смесь должно быть свепереливают в сухую пробирку и оставляют дено к минимуму.на 2 ч при 10 С в темном месте. Определяют Определена зависимость флуоресценфлуоресценцию данного раствора при дли ции раствора от концентрации ТХУ. в котоне волны возбуждающего света 383 нм и рой производится инкубирование. Длярегистрации ире страции при длине света 470 нм. В этого четыре серии образцов смешивались1качестве контрольного раствора испол ьзо- с растворами ТХУ с концентрацией 5, О, 20вана смесь 5 мл 10;-ного раствора ТХУ и и 50 Д, Каждая серия включала восемь проб0,5 мл плазмы крови в отсутствие препара с концентрацией 3 мкг/мл. После инкубирота, обработанная так же, как испытуемый вания в темноте при 10 С была измеренараствор, Концентрация амфотерицина В оп- флуоресценция растворов, Результаты изределяется по градуировочному графику. мерений представлены в табл. 3.С целью обоснования способа проведе- По результатам измерений можно сдены следующие исследования. 40 лать вывод, что увеличение концентрацииОпределено значение максимума по- ТХУ свыше 10 фД приводит к снижению флуглощения света раствором амфотерицина оресЦенции раствора. Поскольку снижениеВ, Определение произведено на спектро- концентрации ТХУ ниже 5 ухудшаетосажфотометре, Полученное значение равно дение белков из биологических жидкостей,383 нм. 45 то оптимальной концентрацией ТХУ при опОпределенадлинаволныиспускаемого ределении амфотерицина В в биологичесвета. Определение произведено на флуо- ских жидкостях можно считать 5-10,риметре, в качестве регистрирующего при- Воспроизводимость предлагаемогобора использован цифровой вольтметр, способа определения амфотерицина Взашунтированный резистором 300 кОм. 50 изучена при параллельном определенииПолученное значение равно 470 нм. десяти проб, содержащих по 1,5 мкг преОпределена зависимость интенсивно- парата, Результаты определения приведести флуоресценции от времени инкубирова- ны в табл. 4.ния. Для этого смешивали 0,5 мл раствора Приведена пригодность метода для оппрепарата концентрацией 3 мкг/мл с 5 мл 55 ределения амфотерицина В в биологиче 10-ной ТХУ и выдерживали в темном мес- ской жидкости - плазме. крови, Для этого вте втечение бч, Периодически производили двух параллельных сериях опытов опредеизмерение интенсивности флуоресценции лялось содержание препарата - в одномраствора. Полученные результаты приведе- случае препарат добавлялся в дистиллироны в табл. 1. ванную воду, в другом - к плазме крови,300 -ф Концентрация препарата в обоих случаях была равна и составляла 2 мкг/мл, Обработка каждой серии проводилась одинаково, в соответствии с примером выполнения определения. Результаты,.полученные в каждой 5 серии, совпадали. Таким образом, показана возможность определения амфотерицина В в плазме крови, так как последняя не содержит мешающих определению веществ.Было показано, что градуировочный 10 график при определении амфотерицина В линеен в пределах 0,03 - 12 мкгlмл (исходная концентрация), что соответствует содержанию в пробе от 0,015 до 6 мкг.В табл, 5 дается сравнительная характе ристика методов количественного определения амфотерицина В.Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить затра 20 ты времени на проведение анализа, значительно удешевить и упростить его, сделатьболее доступной возможность проведенияанализа в клинической практике,Формула изобретения Способ определения эмфотерицина В в крови, включающий взятие пробы с последующим ее биохимическим анализом, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения экономичности, пробу смешивают с 10 О-ным раствором трихлоруксусной кислоты в соотношении 1:10, центрифугируют, инкубируют 2 ч в темноте при 5 С, флуориметрируют при длине волны возбуждающего света 383 нм и длине волны регистрации 470 нм, а концентрацию амфотерицина В рассчитывают по калибровочной кривой.Прим блица 5 Коррект едактор кова ороль Тира,СССР оизводствен но-издательаказ 2392 ВНИИПИ Госу ственн 1130 нее арифметическое; О - выборочная квадратичная ошибкафициент вариации; В - доверительный интервал. ставитель Н.Теренинахред М.Моргентал к Подписноеомитета по изобретениям и открытиям при осква, Ж, РаушскаФ наб 4/5 й комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10