Способ включения водорастворимого препарата в тени эритроцитов

СОВеТСКИхСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 51)5 А 61 К 47 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ невскотабл,сится испол спор арато х пут к области медизовано для наа лекарств и в при заболевай. Изобретение отнцины и может бытьправленного трандиагностических прениях печени и желчн ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 21) 4783026/14(54) СПОСОБ ВКЛЮЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПРЕПАРАТА В ТЕНИ ЭРИТРОЦИТОВ(57) Изобретение относится к медицине иможет быть использовано для направленного транспорта лекарств и диагностическихпрепаратов при заболеваниях печени и келчных путей. Цель изобретения - повышениеэффективности включения лекарственных идиагностических препаратов в эритроцитарные тениносители и устойчивости к деЦепь изобретения - упрощение способа, а также увеличение содержания препарата в тенях и их устойчивости.Цель достигается тем, что гипоосмотический гемолиз осуществляют в дистиллированной воде при 0 С при соотношении клетки и лизирующего раствора 1:7, затем осаждают эритроцйтарные тени центрифугированием, недостаточную жидкость сливают, к осадку добавляют препарат, растворенный в охлажденной до 0 С диссорбции препарата в кровеносном русле, Цель достигается тем, что проводят гипоосмотический гемопиэ в дистиллированной воде при температуре 0 пои соотношении клетки и лизирующего раствора 1:7, затем осаждают эритроцитарные тени центрифугированием, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют препарат, растворенный в охлажденной до 0 С дистиллированной воде из расчета 1:6 - 1:7 и инкубируют в течение 15-20 мин при 4 С, Способ позволяет повысить в 2,5 - 3 раза концентрацию препарата в конечном продукте, упростить процедуру включения препаратов в эритроцитарные тени, сохранить устойчивостьтеней кдесорбции в кровеносном русле и создать длительные концентрации препарата в печени и желчных путях,1 .гтиппированной воде из расчета 1:6-1:7, иинкубируют в течение 15 - 20 мин при 4 С.Способ осуществляют следующим обра Периферическую венозную кровь в количестве 5 мл помещают в пробирку с гепарином 25 Ед/мл), После удаления плазмы крови эритроциты дважды отмывают физиологическим раствором хлористого натрия путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. К осадку эритроцитов добавляют семикратный объем охлажденной до ОС дистиллированной воды и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 25 мин при 4 С, Насадочную жидкость, в которой содержится гемоглобин, отсасывают, к полученным теням эритроцитов прилилают семикратный объем антибиотика или другого препарата, растворенного в охлакденной до 0 С дистиллированной воде. Взвесь инкубируют втечение 15 - 20 мин при 4 С. Затем добавляют 1/9 объема 9%-ного хлористого натрия для восстановления целостности мембраны эритроцитов и инкубируют в течение 30 мин при 37 С.Время центрифугирования при 8000 об/мин 25 мин является оптимальным, так как именно через зтот промежуток времени тени хорошо выпадают в осадок. Об этом судили по светлой окраске надосадочной жидкости,В способе осуществляют раздельное получение эритроцитарнь 1 х теней и разведение препарата в дистиллированной воде, Затем (после удаления надосадочной жидкости) выполняют инкубацию эритроцитарных теней в растворе препарата, Это предупреждает связывание перпарата гемоглобином и повышает выход конечного продукта,Разработанные для способа режимы инкубации и обьемные соотношения позволяют также повысить выход конечного продукта, устойчивость эритроцитарных теней к десорбции препарата в кровеноснол 1 русле. Так, соотношение клетки и лизирующего раствора 1:6 и более, а также температура раствора ниже 0 С способствует значительному разрушению эритроцитарных мембран и потери ими транспортных свойств. Однако уменьшение соотношения клетки и лизирующего раствора приводит к большой задержке гемоглобина в тенях, что не желательно, так как гемоглобин связывает препарат. Выбранное соотношение 1:7 является оптимальным и, как показывают результаты. исследований, допустимым, не приводит к значительному разрушению зритроцитарных теней. Они сохраняют транспортные свойства и устойчивость кдесорбции препарата в кровеносном русле. Сопоставление эффективности различных режимов инкубации позволило установить, что агодпительность не влияетсущественно на выход конечного продукта, Так, при инкубации в течение 5 мин содержание антибиотика в тенях составило 11,2:- 0,5 мкг/мл, в тсчение 15 мин - 12,4 ь 0,3 мкг/мл,30 мин - 12,4 + 0,4 мкг/мл,При добавлении препарата в лизирующий раствор (согласно известному способу) выход конечного продукта был минимальным. Так, процент включения канамицина при растворении его в лизирующем растворе составил 4,7 й 0,6, а при включении по предлагаемой методике - 12,4 + 0,3 мкг/лл, т,е. почти в 3 раза больше. При включении50 55 тенях доноров контрольной группы, где содержание препарата определялось тотчас после однкратного отмывания эритроцитарных теней, Изложенное свидетельствует о достаточной устойчивости эритроцитарных теней на десорбцию и выделение гентамицина из теней в кровеносном русле.Устойчивость эритроцитарных теней и возмокность доставки препарата в печень была изучена в эксперименте на беспородных собаках, у которых оперативным путем моделировали острый холецистит. Животных разделили на две группы: основную и бил игноста по известному способу в эритроцитарные тени и введении последних в вену контрастирования желчных путей не происходило, Включение билигноста (500 ь) в тени 5 по предлагаемой методике позволяет хорошо контрастировать желчные пути. Причем метод позволяет в 3 - 4 раза снизить расход дозы билигноста. Так, при традиционном внутривенном способе введения билигно ста для контрастирования тени желчного пузыря требуется ввести 20-,50 мл 500/-ного билигноста, а при использовании предлагаемого способа достаточно в эритроцитарные тени включить 6 - 7 мл билигноста, 15 Таким образом, обнаружен эффект - контрастирование желчных путей при внутривенном введении 6 - 7 мл 50%-ного раствора билигноста, предварительного включенного в эритроцитарные тени. Традиционное 20 внутривенное введение 6 - 7 мл билигностане вызывает контрастирования желчных путей и для этого требуется не менее 20 мл 50;4-ного раствора билигноста.Для изучения устойчивости эритроци тарных теней-носителей, полученных попредлагаемой методике, на возможную. десорбцию и выделение антибиотика из теней в кровеносном русле, проводили специальные исследования с гентамицином. Эритро цитарные тени доноров с включеннымгентамицином дважды отмывали физиологическим раствором хлористого натрия и затем инкубировали в аутологичной плазме при 37 С в течение 25 мин. Содеркание 35 гентамицина в надосадочной жидкости после первого отмывания эритроцитарных теней составило 0,4 й 0,03%, после второго отмывания физиологическим раствором - 0,04+ 0,0070/0. В плазме крови после инку бации в ней эритроцитарных теней, содержание гентамицина равнялось 0,2 + 0,008%, т.е, было минимальным, Количество гентамицина в самих эритроцитарных тенях после их двухкратного отмывания и инкчбации 45 в аутологичной плазме крови составило 26,3 .+х 0,1% против 3,1 . 0,3% в зритроцитарных1718955 Составитель С.РыбалкинТехред М.Моргентал Корректор М,Демчик Редактор Н,Яцола Заказ 718 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 контрольную. В контрольной группе собакам вводили канамицин (30 мг/кг) традицис онным внутривенным способом один раз в день. В основной группе канамицин вводили в аналогичной дозе(30 мгlкг), но предва рительно включенный в аутологичные эритроцитарные тени, которые затем вводили внутривенно также один раз в день. Через 24, 48 и через 72 ч после последнего введения антибиотика животных выводили 10 из опыта, выполняли релапаротомию, визу-. альный осмотр внутренних органов, а также фармакокинетические исследования концентрации канамицина в ткани печени и сыворотке крови общеизвестным методом 15 диффузии в агар, в качестве тест-микроба использовали Васс Поз зцЫВз АТСС 6633.Фармакокинетические исследования выявили значительные различия в концентрации кэнамицина в ткани печени в зависи мости от способа введения препарата (таблица ).Из таблицы видно, что при направленном транспорте кэнамицина в зритроцитарныхтенях в печень в ткани печени создается 25 длительная терапевтическая концентрация препарата в сравнении с традиционным внутривенным способом введения, Это указывает на эффективность предлагаемого способа, а также на возможность использо вания и устойчивость зритроцит рных теней, При традиционном внутривенном способе введения препарата он не определяется в ткани печени.Способ позволяет повысить в 2,5 - 3 раза концентрацию препарата в конечном продукте(12,4 .ф,3 против 4,7 ч,6 в прототипе), упростить включение препаратов в зритроцитарные тени (применение на всех этапах способа дистиллированной воды, вместо требующих специальных реактивов и времени для приготовления, а также малодоступных для широкой клинической практики растворов триса и фосфатного буфера). а также сохранить устойчивость зритроцитарных тканей в кровеносном русле и создать длительные концентрации препарата в печени, Это доказано специальными фармакокинетическими исследованиями,Формула изобретения Способ включения водорастворимого препарата в тени зритроцитов путем гипоосмотического шока нативных зритроцитов и инкубации их в растворе препарата, о т ли ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, а также увеличения содержания препарата в тенях и их устойчивости, гипоосматический шок осуществляют охлажденной до ОС дистиллированной водой при соотношении 1;7, а для инкубации используют отмытые тени зритроцитов и охлажденный до 0 С водный раствор препарата, причем инкубацию проводят при 4 С не менее 15 мин.