Способ определения углеводородокисляющей активности микроорганизмов

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХ 1717629 ЕСПУБЛИК 9 у ИЯ ВИДЕТЕЛЬСТ АВТОРСКО нелли О- КГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ. ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗОБ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МИРООРГАНИЗМОВ(57) Изобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может бытиспользовано при определении концентра Изобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может быть использовано при определении концентрации углеводородокисляющих бактерий и микромицетов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий,Особенностью усвоения мицелиальными грибами и бактериями жидких углеводородов нефти является обязательное наличие двухфазной среды: жидкий углеводород - водно-минеральный раствор, в которой при развитии микромицетов и бактерий происходит образование биомассы на границе фаза в водной фазе - накопление продуктов метаболизма.Известен способ определения концентрации микроорганизмов, заключающийся в том, что пробу микроорганизмов инокулируют в лактознцй бульон, содержащий С -за 14 505 С 12 И 1/20,С 120 1 ции микроорганизмов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий. Целью изобретения является повышение точности определения активности углеводородокисля ющих микроорганизмов. Способ заключается в инкубировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной среде, например жидкий углеводород - водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно вводят радиоактивный изотоп - тритий, при 25 - 30 или 30 - 37 С в течение 10 - 15 или 1 - 3 сут для микромицетов или бактерий соответственно, после чего проводят отделение биомассы и водной фазы, 3 табл. мещенную лактозу, и подвергают инкубированию в течение определенного временипри 37 С, Концентрацию микроорганизмовоценивают по количеству выделяющегосярадиоактивного С 4 О 2,14Недостатками способа являются неизбежное искажение результатов. исследования, сопряженное с потерей С 02 в14процессе его улавливания, с влиянием банальной микрофлоры, а также невозможность определения их активности,Наиболее близким к предлагаемомуспособу по технической сущности являетсяспособ определения концентрации микроорганизмов, заключающийся в измерениирадиоактивности нативных и термоанактивированных микроорганизмов, причем инку 15 ирование нативной пробы с радиоактивнымизотопом проводят при 2 - 8 С в течение 18 -24 ч, а инактивированной - при той же температуре не менее 2 ч. В качестверадиоактивного изотопа используют Р в32 виде двухзамещенного фосфорно-кислого натрия. С помощью калибровочной кривой по уровню активности Р, который включается в клетки при ассимиляции, находят концентрацию живых микроорганизмов. Г 1 о концентрации микроорганизмов можно судить об активности их развития.Недостатком известного способа является ограниченная возможность его практического применения, а также недостаточная точность определения активности,Например, в ряде случаев возникает необходимость определения наряду с концентрацией микроорганизмов их водорастворимые метаболиты. Так, при протекании микробиологических процессов в топливных емкостях в системах техники в засорении топливных агрегатов существенную роль играет биомасса, а в процессе повреждения материалов топливных систем - водо- растворимые продукты метаболизма (органические кислоты, аминокислоты и т.п.). Поэтому для достоверной оценки микробиологического засорения топливных емкостей и систем техники в случае выделения из них бактерий и микромицетов требуется определить углеводородокисляющую активность выделенных микроорганизмов. Углеводородокисляющая активность оценивается по количеству биомассы либо водорастворимых метаболитов, образую. щихся при развитии бактерий и микромицетов в углеводород - водно-.минеральной среде. Однако известный способ не позволяет учитывать кроме концентрации микроорганизмов (биомассы, ассимилирующей изотоп Рз 2) другие продукты жизнедеятельности микроорганизмов.Целью изобретения является повышение точности определения.Способ заключается в культивировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной, среде: жидкий углеводород-водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно введен радиоактивный изотоп - тритий (Нз) при 25-30 С или 30-37 С в течение 10-15 или 1-3 сут для бактерий и микромицетов соответственно, после чего проводят отделение биомассы (клеток микромицета или бактерий) и водной фазы. Возможность осуществления способа обусловлена применением радиоактивного изотопа трития, введенного в концевую группу н-октадекана, который живце клетки гриба поглощает и окисляет его в стеариновую кислоту. Едимственный протон в карбоксильной группе (Нз) является подвижным и обменивается с10 15 воримые метаболиты. Указанное обстоятельство расширяет возможности способа 20 организмов 25 30 35 40 45 50 55 внешней средой ( водно-минеральным раствором); СНз(СН 2)16 СН -ф СНз(СН 2)16СООН + СНз(СН 2)16 СОО Таким образом, использование в качестве радиоактивного изотопа трития, введенного в углеводородную фазу, позволяет по его накоплению в биомассе и в водной Фазе учитывать и определять наряду с концентрацией углеводородокисляющих микромицетов или бактерий и их водорастподготовки проб живых микроорганизмов и повышает объективность определения активности углеводородокисляющих микроОпределение активности углеводородокисляющих микроорганизмов заключается в измерении радиоактивности биомассы (клеток) микроорганизмов и водной фазы, содержащей водорастворимые метаболиты, образовавшихся при культивировании исследуемых штаммов бактерий или микромицетов в двухфазной среде жидкий углеводород - водно-минеральный раствор, в углеводородную Фазу которой предварительно введен н-октадекан, меченный по концевой группе Н, при благоприятных для развития микроорганизмов температурах (30-37 С для бактерий, 25 - 30 С - для микромицетов) в течение 1 - 3 (бактерии) или 10 - 15 сут (микромицеты) и сравнении полученных значений с величиной радиоактивности биомассы и водной фазы, образовавшихся при культивировании в аналогичных условиях известных активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, Время инкубирования микромицетов определяется логарифмической фазой роста, в которой наиболее интенсивно протекают процессы образования биомассы и накопления продуктов жизнедеятельности и которая при развитии микромицетов в углеводород-водно-минеральной среде составляет 10-15 сут, а для бактерий - 1-3 сут, Температура 25-30 и 30-370 С выбрана как наиболее благоприятная для развития углеводородокисляющих микромицетов и бактерий соответственно,В табл. 1 приведены данные по накоплению радиоактивного изотопа в водной фазе и биомассе штаммов микроорганизмов, выделенных из топлив при их развитии в углеводород-водно-минеральной среде, вКонтрольные варианты необходимы для учета явлений гашения сцинтилляции, возникающих в связи с окраской биомассы и минерального раствора, а также обработанной биомассы солюбилизатором.Инкубирование приготовленных смесей проводят при 25 - 30 С в течение 10 - 15 сут без принудительного встряхивания.Для получения средней (из трех повторностей) пробы биомассы обьединяют и одновременно обрабатывают биомассы, выросшие в трех разных пробирках одного варианта. Выросшие на границе раздела фаз топливо-инеральный раствор биомассы микромицетов (в виде пленки) микологическим крючком переносят в чистую сухую пробирку и промывают на холоду охлажденным до 4 ОС додеканом последовательно 4-5 раз, причем каждый раз новой порцией (1 мл) додекана. Охлаждение необходимо для предотвращения процессов окисления н-октадекана и потери радиоактивной метки при промывании биомассы,Биомассу, отмытую от сорбированного на ее поверхности углеводорода, гомогенизируют в механическом диспергаторе в 2 мл солюбилизатора (солюбилизатор Тфирмы Спзьег АпауОс, 6 МВН).В сцинтилляционные флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционной жидкости (ЖС; раствор 5 г 2,5-дифенилоксазола и 0,2 г и-бис-(5-фенилоксазоил)-бензола в 1 л сцинтилляционного толуола) вводят пробы минерального раствора (100 мкл) из каждой пробирки в отдельный флакон и средние пробы биомассы в растворе солюбилизатора (500 мкл).Измерения радиоактивности препаратов проводят на жидкостном сцинтилляционном счетчике радиоактивных излучений, например МагК-(Голландия).По полученным результатам производят перерасчет радиоактивности препаратов каждой . фракции (биомассы, минерального раствора) с учетом отобранного для анализа объема пробы и общего количества фракции. углеводородную фазу которой предварительно введен н-октадекан-Н, Для получезния объективных результатов дляисследования выбраны штаммы, образующие при росте в углеводород-водно-минеральной среде различную биомассу. Вбиомассе штаммов с условными номерами1, 8 и 15 обнаружено практически одинаковое количество радиоактивного индикатора. В то же время штамм С,гезпае10накапливает в водной фазе значительнобольшее количество радиоактивного индикатора по сравнению со штаммами 1 и 8. Внаибольшей степени способность образовывать водорастворимые продукты жизнедеятельности выявлена у штаммаС.гезпае. Наименьшее количество радиоактивного индикатора установлено как вбиомассе, так и в водной Фазе штамма 1701,В биомассе штаммов Асгепопоп Иепзе и 20СЬгузозрогап вр. обнаружено приблизительно одинаковое количество радиоактивного изотопа, в то время как в водной фазе .А,Ьевое содержание изотопа в 5 раз выше,чем в водной фазе СЬгузозрогЬгп вр. При 25культивировании штаммов Репсоа.)епзеп и Рзеосогпопаз зр. основное количество радиоактивного изотопа накапливается в водной Фазе, а при культивироЬанииМусоЬастегшв зр. - в биомассе. 30Таким образом показано, что перераспределение радиоактивного индикаторапроисходит в зависимости от углеводородакисляющей способности штамма с учетомего способности образовывать как биомассу, так и водорастворимые продукты жизнедеятельности, в том числе органическиекислоты. Это позволяет проводить измерение радиоактивности непосредственно вбиомассе (клетках), а также в водной и углеводородной фазах после инкубированиямикромицетов с меченым соединением.Как видно из табл. 1, из пяти штаммовС.гезпае штамм 16 является наиболее активным, так как для него установлено наибольшее накопление радиоактивногоизотопа в биомассе и водной фазе, Длясравнения в табл, 1 приведены данные поколичеству сухой биомассы, образуемой.ис-следуемыми штаммами, исходя из которых 50наиболее активным считают штаммС.гезпае. Использование способа позво-.ляет учесть наряду с образующейся биомассой накопление водорастворимыхпродуктов метаболизма, что повышает обьективность определения активности углеводородокисляющих микромицетов,П р и м е р 1, В каждую из 12 пробирок(по 3 пробирки на каждый вариант) наливают по 3 мл водного минерального раствора,имеющего следующий состав,;: азотнокислый калий 0;2: сернокислый магний 0.04; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,03; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,07; рН раствора 7. Затем вносят по 0,3 мл суспензии спор гриба исследуемого штамма и штамма сравнения с концентрацией 10 спормл и добавляют по 0,5 млбн-додекана с введенным в него н-октадеканом, меченым по концевой группе тритием (удельная активность 2,45 мКи/мл).1717629 радиоактивности клеток и водной фазы, показала большую активность штамма сравнения (табл. 3).Способ позволяет достоверно определить активность углеводородокисляющих микроорганизмов, что имеет большое практическое значение при выборе штаммов для оценки биостойкости топлив, в том числе вновь разрабатываемых, Объективная оценка микробиологической устойчивости нефтяных дистиллятных топлив позволит избежать отказы и неисправности топливной системы техники, вызванные биологическим повреждениям топлив. 20 25 30 Таблица 1 Количество н-октадекана-Н,мкМВ био- массе С 1 абозрог цпгез 1 пае С. гез 1 пае С, гез 1 пае С. гез 1 пае С. гез 1 пае Асгегпоп ЬгпЫ 11 ецзеСЬгузозрог 1 ша зрРепс 111 ца 1 ецзеп 1Азрег 911 цз чегз 1 со 1 огРгецбогпопаз зр.М соЬастег 1 оа з . 0,0084 0,0082 0,0081 0,0060 0,0036 0,0184 0,0178 0,0066 0,0022 0,0031 0,0045 0,0380 0,0355 0,0442 0,0522 0,0075 0,0503 0,0102 0,0436 0,0098 0,0128 0,0012 0,0464 0,0437 0,523 0,0582 0,0111 0,0687 0,0280 0,0502 0,0120 0,0159 0,0057 64 61 62 47 28 128 121 52 15 18 21 П р и и е ч а н и е: Количество н-октадекана-Н в исходном топливе 1,4038 мкМ,зДоверительный интервал с 95 %-ной вероятностью составляет+ 11 ,. Оценка активности исследуемого микромицета, произведенная в сравнении с активностью известного штамма, показала большую активность исследуемого штамма (табл. 2).П р и м е р 2. В приготовленную по примеру 1 среду (углеводород - водно-минеральный раствор) вносят по 0,3 мл суспензии клеток бактерий исследуемого штамма и штамма сравнения с концентрацией 10 клеток/мл (по стандарту мутности). Инкубирование приготовленных смесей проводят при 30-37 С в течение 1 - 3 сут при перемешивании (120 об/мин).После инкубации с изотопом клетки исследуемого и сравниваемого штаммов бактерий отделяют от водной фазы, а затем трехкратно отмывают охлажденным до 4 С додеканом с последующим сливом супернатанта и ресуспензированием осадка (клеток) в 2 мл солюбилизатооа,Б сцинтилляционные флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционной жидкости, вводят пробы водной фазы (200 мкл) иэ каждой пробирки в отдельный флакон и сред де пробы клеток бактерий в растворе солюэилизатора (500 мкл).Измерение и расчет радиоактивности препаратов проводят по примеру 1.Оценка активности исследуемого штамма бактерий, произведенная в сравнении с активностью известного штамма по сумме Формула изобретения Способ определения углеводородокисляющей активности микроорганизмов, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в оптимальных условиях с радиоактивнымизотопом с последующим его определением в биомассе, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, культивирование проводят в двухфазной среде, состоящей из жидкого углеводорода и водно-минерального раствора, содержащей в качестве жидкого углеводорода н-октадекан, меченный по концевой группе тритием, и дополнительно проводят определение радиоактивного изотопа в водной среде.1717629 10 Табл и ца 2 Доверительный интервал с вероятностью 95 составляет Таблица е. Доверительный интервал с вероятностью 95 составляет + 11. име Составитель И,болотинаРедактор И.Дербак Техред М.Моргентал Корректор О,Кундри роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 аказ 853 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва,. Ж, Раушская наб., 4/5