Способ генетической трансформации растений

(5 цю С 12 й 15/87 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Инстюуг экологической генетики АН МССР(56) Арр. МсгоЫо Вотесппо, 1985, ч.21,р.336.Во 1 есппооду апб Есооду о 1 Роиеп,1986, р.р. 59-76.РгосЫ. йат, Асад Яс, 1986, ч.83, р.715720,(54) СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТЕНИЙ(57) Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано в Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано в селекции культивируемых растений. Известен способ генетической трансформации растений, включающий проведение микроиньекции чужеродной ДНК в протопласты растений.Известен также способ, согласно которому экзогеннуа ДНК вводят в протопласты растений методом электропорации.Однако указанные способы мало пригодны для многих однодбльных растений, в частности злаковых, Применение данных способов затруднено тем, что для злаковых обычно сложно получить растение из протопластов,Известен также способ генетической трансформации, предусматривающий использование бактерий АдгоЬас 1 егца БЦ, 1708849 А 1 селекции культивирчемых растений. Цель изобретения - увеличение эффективности трансформации, Способ заключается в том, что определенные гены переносят в геном растения посредством вектора на основе Т-плазмидьу, содержащей маркерный ген (устойчивость к антибиотику), причем опыление проводят после нанесения плазмидной ДНК в растворе сахарозы, борной кислоты и Са(ИОз)2, а отбор трансформантов проводят на селективных средах, в частности среде Кно па, содержащей канамицин. Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Частота трансформации составляет 0,6 - 1,45,вве 1 асепз для переноса генов с помощью векторов, основанных на Т-плазмиде.агойТакой способ практически неприемлем для однодольных растений, поскольку Алоае 1 асепэ не обладает вирулентностью по отношению к ним.ЖИзвестен способ генетической транс- Оф формации растений, например табака, за- Ф ключающийся в том, что пыльцу О проращивают на среде, содержащей экзогенную ДНК еаиде Т.пааамиды. Пророс. )са шую пыльцу наносят на рыльце пестика, Затем клетки ткани анализируют на нопалинсинтетазную активность, на основе чего судят о генетической трансформации.Известен также способ генетической трансформации растений, согласно которому рыльца растений инкубируют в присутствии ДНК плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, в частности кканамицину, Методом электропорации вводят плазмидную ДНК в пыльцевые зерна растений, затем растение опыляют и селекцию трансформантов в полученном потомстве проводят по устойчивости к канамицину.Однако известные способы неприемлемы для растений, у которых жизнеспособность пыльцы в значительной степени зависит от времени хранения, например кукурузы и других злаковых.Наиболее близким к предлагаемому является способ, заключающийся в том, что с растений кукурузы собирают пыльцу, готовят пасту из смеси: пыльца, раствор сахарозы, экзогенная ДНК, Экзогенную ДНК выделяют иэ линий кукурузы, содержащих в себе маркерные гены окраски эпидермиса семян, Приготовленную смесь наносят на рыльца пестиков растений. Частоту трансформации оценивают по частоте появления на початках окрашенных зерен,Недостатки этого способа заключаются в том, чтотрансформация носит невекторный характер;отсутствует легко селектируемый маркерный ген, чаличие которого позволило бы быстро и эффективно отобрать трансформанты;отсутствует возможность получения достаточного количества семян, необходимых для анализа, ввиду их слабой эавязываемости.Цель изобретения - увеличение эффективности трансформации,Способ включает обработку рыльца пестика растений смесью пыльцы и экзогенной ДНК в растворе сахарозы, использование вектора на основе Т 1-плазмид, например, серии РСЗ, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам, при этом плазмиду смешивают с раствором сахароэы, борной кислотой и Са(МОз)2, причем смесь сразу же наносят на рыльце пестика и немедленно производят опь 1 ление, а отбор трансформированных растений проводят путем проращивания на среде Кнопа, г/л: Са(ИОз)г 0,8; КН 2 РО 4 0,2; М 904 х 7 Н 20 0,2; КИОз 0,2; ГеРОа 0,1, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мл.Готовят смеси следующего состава: 0,4- 0,5 М сахарозы; 0,017-0,020% борной кислоты; 0,038-0,042% Са(НОз)2; рН 5.5-5,8;40-100 мкг/мл плазмидной ДНК(например, РОЧ 1501), содержащей ген устойчивости к канамицину.П р и и е р 1, В смесь, включающую 0,4 М сахарозы, 0,018% борной кислоты, 0,04% Са(МОз)2, (рН 5,5-5,8), непосредственно пе 5 10 15 20 25 30 35 40 ред нанесением на рыльце пестиков вводят плазмйдную ДХК (РОЧ 1501), содержащую ген устойчивости к канамицину, в количестве 70 мкг/мл. На каждый початок кукурузы линии Из (предварительно изолированный) сразу же наносят 200 мкл смеси, после чего немедленно опыляют его же пыльцой, После созревания семена проращивают на среде Кнопа. Затем 1-2-дневные проростки переносят на среду Кнопа, содержащую канамицин в концентрации 400 мкг/мл, Через 10-14 сут. растения, прошедщие отбор на этой среде, переносят в грунт в условиях климокамеры (20 люкс - 16 ч, температура днем 28 .ф.10 С, ночи 19 .ф.1 С) идоращивают для пересадки в открытый грунт.Часть растений на стадии проростков анализируют методом блотгибридизации по Саузерну для доказательства интеграции в геном растения интересующего гена.Частота трансформантов, полученных при использовании предлагаемого способа, составляет около 0,6%,П р и м е р 2, В смесь, содержащую 0,45 М сахароэы, 0,017% борной кислоты, 0,038% Са(ИОз)2, рН 5,5-5,8, вносят плазмидную ДНК, содержащую ген устойчивости к канамицину. Смесь наносят на рыльце пестика томата и немедленно опыляют, Созревшие семена проращивают на среде Кнопа с канамицином (100 мкг/мл). При использовании сорта томата "Факел" частота трансформации составляет 1,45%.В прототипе на один ген частота трансформации составляет около 0,3%, т,е. полученная в результате использования предлагаемого способа частота трансформации в 2 раза превосходит полученную в известном способе. Анализ трансформантов методом блот-гибридизации по Сауэерну показал, что ген устойчивости к канамицину встроился в растительный геном,Таким образом, оценка следующих поколений предполагаемых трансформантов отбором на селективных средах и методом блот-гибридизации показывает эффективность данного метода трансформации,Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Способ позволяет также сократить время между сбором пыльцы, приготовлением смеси и опылением растений, что не вызывает ощутимого воздействия физических факторов и нуклеаз на ДН К, пыльцу и пыльцевые трубки (механические разрывы, деградация и др.),Способ может быть использован для целенаправленной трансформации генома растений.1708849 Формула изобретения Составитель В,Бурилков Редактор Л.Павлова Техред М.Моргентал Корректор М,ШарошиЗаказ 403 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб,; 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент, г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Способ генетической трансформации растений, включающий смешивание экзогенной ДНКс пыльцой растения, нанесение полученной смеси на рыльце пестика в растворе сахарозы, отбор трансгенных растений, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения эффективности трансформации, в качестве экзогенной ДНК используют вектор на основе Т-плазмиды, несущей устойчивость к антибиотикам и встроенный ген, смешиваниес пыльцой проводят в растворе 0,4-0,5 М сахарозы, 0,017-0,020 5 борной кислоты, 0,038-0,042 Са(МОЗ, рН5,5-5,8, после нанесения на рыльце пестика немедленно проводят опыление, а отбор трансгенных растений проводят путем проращивания на среде Кнопа, содержащей ка намицин в концентрации 250-400 мкгlмл,