Способ титрования вируса иммунодифицита человека

(я)5 С 12 й 7/00, 5/ ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ СВИДЕТЕЛЬСТ К АВТОРСК С.С, Матура ткани ан иях. - М.:(71) Научно-исследовательский ирусных препаратов АМН СССР(54) СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ ВИМУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Изобретение относится к вирусологии.Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека (ВИЧ),П р и м е р 1. Культивирование диплоидных клеток эмбриона человека штамма Лпроводят по известной методике. На моно- слой ДКЧ, выращенный в чашках Петри размером 36 х 10 мм, наносят взвесь лимфоидных клеток линии МТв количестве 1,5 х 10 кл/мл, чувствительные к цитопатическому действию ВИЧ, В культуру добавляют среду следующегосостава: среда ВРМ 1-1640, 10 сыворотки плодов коровы, 006 глутамина и 50 мкг/мл гектамицина. Чашки с культурой помещают в термостат с 5 СОг при 37 С; На следующий день питательную среду удаляют, культуру просматривают под микроскопом и отбирают ту. где образовался монослой лимфоидных клеток,(57) Изобретение относится к вирусологии, Целью изобретения является упрощение способа титрования вируса иммунодефицита человека. Указанная цель достигается тем, что проводят заражение вирусом иммунодефицита человека клеточной системы. При этом клеточную систему создают путем культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя, после чего на него наносят взвесь лимфоидных клеток в концентрации 1,5 - 2,0 х 10 клеток в 1 мл. Титр6вируса определяют путем подсчета бляшек на 5 - 7-е сутки после заражения, 4 табл,На прикрепившихся лимфоидных клетках проводят титрование вируса, используя на каждое разведение по две чашки, Культуру оставляют для адсорбции вируса на 1 ч при 37 С в термостате с 5 СОг Затем жидкость удаляют, клетки промывают средой ВРМ 1-1640 и заливают питательную среду ВРМ 1-1640 с 20 сыворотки плодов коровы, 0,06;6 глутамина, 50 мкг/мл гектамицина и среду Игла в равных объемах. Культивирование проводят в термостате при 37 С с 5 СОг. На 6-е сутки питательная среда удаляется и на монослой клеток наносится 0,1-ный раствор нейтрального красного в количестве 1 - 2 мл, Чашки с культурой помещают в термостат на 30 мин при 37 С, а затем их просматривают и подсчитывают образовавшиеся бляшки просветления на окрашенном в розовый цвет фоне.1696474 Ытамм ВИЧ Титрвируса,БОЕ/мл Данные при разведении вируса 1010 1010+,11100 88 7 Нет Нет Таблица 2 Титрвируса,БОЕ/мл Культура Данные при разведении1010 ф . 10а1,5 х 10 Спл. Снл. Спл, 140 Гймфоидные клетки,прикрепленные поли-лиэином16 11 имфоидные клетки на монослое ДКЧ-А1,6 х 10 1 7 х 10 136 135 17 ДКЧ-Л"68 В табл. 1 представлен протокол титрования ВИЧ трех штаммое на монослойной культуре лимфобластов,П р и м е р 2. Лимфоидные клетки наносят на монослой ДКЧ линии Лили Л, Остальные процедуры проводят аналогично примеру 1, В табл. М 2 приводятся данные сравнительного титрования ВИЧ на лимфоидных клетках, прикрепленных на монослое ДКЧ, и на монослое, сформированном с помощью поли:лизина,Иэ табл, 2 видно, что качество монослойных лимфоидных культур, сформированных на основе ДКЧ с помощью поли-Е-лизина, равноценно.П р и м е р 3. Лимфоидные клетки культивируют совместно с диплоидными клетками человека для последующего инфицирования ВИЧ. Обоснование концентраций лимфоидных клеток представлено в табл. 3.Как видно иэ табл. 3, наиболее эфективная концентрация клеток 1,5 - 2 х 10 /мл. Кроме того, табл. 3 позволяет установить, что оптимальным сроком сокультивирования лимфоидных и диплоидных клеток является 24 - 48 ч. Сохранение монослоя на более поздних сроках может ухудшить условия репродукции ВИЧ до образования бляшек. Кроме того, культивирование клеток свыше 48 ч не оправдано экономически(дополнительная смена культуральной среды,использование дорогостоящих антибиотиков и др.),П р и м е р 4, Для выбора оптимальных5 сроков учета бляшкообразования ВИЧ вкультуре клеток проводят ряд экспериментов, усредненные результаты которыхпредставлены в табл. 4 (концентрация 1,5 -2 х 10 кл/мл).10 Из табл, 4 видно, что оптимальным сроком для учета результатое титрования ВИЧявляются 5 - 7-е сутки, так как на более рантних сроках бляшки не образуются, а начиная с 8-х суток идет лиэис культуры клеток,15Формула изобретенияСпособ титрования вируса иммунодефицита человека, включающий созданиечувствительной клеточной системы, ее зара 20 жение вирусом иммунодефицита человека споследующим определением титра вируса,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа, создание чувствительной клеточной системы осуществляют путем25 культивирования диплоидных клеток человека до стадии монослоя с последующимнанесением на монослой взвеси лимфоидных клеток в концентрации 1,5 - 2 х 10 клетокбв 1 мл, а определение титра вируса осуще 30 ствляют путем подсчета бляшек на 5 - 7-есутки после заражения,Таблица 11696474 Таблица 3а аиеваатваетвтгитете,ватаевтат иее ааваавевгеваава аваев вате татаа Данные при времени культивирования, ч атеееай гат вг 72 , 96 Ионослоя нет Монослоя нет Монослоя нет Ионослоя нет Ионослоя нет Моно слой То, же Монослой Ион оспой ИонослойМонослоя нет Мои оспойнарущен аетате аииавттиаее тгтиваи е и е ааааа аевиеате таввати тег и Таблиц а 4 Время культивирования, сут. Наличиебляшек б у Лизис клетк Составитель С. СветлышевРедактор И, Дербак Техред М.Моргентал Корректор А. Осауленко кэз 4276 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Количество лимфоидных клеток на монослой, кл/мл 0,5"07 х 101,5-2 х 103-Бх 10 Очень густойслойумногоплавающихклеток Очень густойслой, многоплавающихклеток Клетки отпадают, нарувается монослой