Способ определения активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов

)4 Я м 6 ЕТЕНИЯ. состояния сенсибилизаци определенным антигенам стики иммунопатологичес Цель изобретения - упрощ счет применения желатин клеток в малом объеме, Д весь осаждают в среде 199 тином, осадок помещают в для иммунологических ре ют 30 мин при комнатной тем 300 мин при 4 С, посл исследуемую культуральн кубируют 18-24 ч при 37 С миграции и по их разнице те судят об активности фак щего миграцию лейкоцито опогии 172-178. КТИВНО ГО МИГ следованиастности к а, ингибикрови, что едованиях% ИМ="100(%),А - увеличение зоны миграции в контрои в опыте льтуральны мигра ледуемой Б - увеличениев присутствии исреды); оцент ингибиции миграции иковзвесь, полученную я гепаринизированной отмывали средой 199, вки суспендировали в и сывороткой крупного С) в концентрации 1 х ивировали в течение 1 ч агглютинином (ФГА) в в объеме 2 мл. После етки трижды отмывали вировали в той же конГОСУДАРСТВЕННЬЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯ 4 И ОТКРЫТИЯМпРи Гкнт сссР ОПЙСАНИ ИЗОБ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЯЬС ГВУ(71) Институт клинической иммунСО АМН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСТИ ФАКТОРА, И Н ГИ БИ Р гЭЩРАЦИЮ ЛЕЙКОЦИТОВ(57) Изобретение относится к исям биологических материалов, в чопределению активности акторрующего миграцию лейкоци":овможет быть использовано в ссл Изобретение относится к исследованиям биологических материалов, в частности к определению фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов.Цель изобретения - упрощение предлагаемого способа - достигается -,-ем осаждения лейковэвеси в среде с 1%-ным желатином с последующей. инкубацией осадка в лунках иммунологического планшета в течение 30 мин при комнатной температуре (для оседания клеток на дно лунки), а затем 30 мин при 40 С (для образования твердого геля, в котором сконцентрированы лейкоциты), После этого в лунки добавляют исследуемую культуральну,о среду и инкубируют планшет при 37 С не менес 18 ч, после чего измеряют зоны мирации клеток и рассчитывают активнос, ь фактора и.1 гибирующего миграцию лейкоцитов, по формуле леикоцитов.Пример 1,Лепутем расслаиваникрови трех доноровпосле третьей отмьсреде 199 с 5%-норогатого скота (СКРх 10 кл)мл и культ6при 37"С с фитогемразведении 1:1000культивирования клсредой 199 и культи и Т-лимфоцитов к с целью диагноких заболеваний.ение способа за а для удержания ля этого лейковзс 1%-ным жела- лунки планшета акций, инкубирутемпературе. За. е чего добавляют ую жидкость, ин, измеряют эоны в контроле и опытора, ингибирую5 10 15 20 30 центрации еще 18 ч при 37"С в среде 199 с5%-ной СКРС(опыт). Контрольные культурыпроводили также, но без добавления ФГА.,. После культивирования забирали надосадочную жидкость, которую центрифугировали при 300 об/мин в течение 10 мин дляудаления остатков клеток, после чего тестировали на активность фактора ингибициимиграции.К 4,5 мл гепаринизированной крови добавляли 0,5 мл 10%-ного раствора желатина, инкубировали 45 мин при 37 С лейковзвесь дважды отмывали средой 199 и одинраз средой 199 с 1%-ным желатином, Надосадок сливали, остатки удаляли стерильным марлевым тампоном, осадок встряхивали и разносили по 2 мкл в центр углубления У-образных лунок планшета ("Флоу",Шотландия). Планшет инкубировали 30 минпри комнатной температуре, 30 мин - при4 С и добавляли по 0,1 мл среды 199 с 5%ной СКРС. Затем, оставив в качестве контроля по две лунки от каждого донора, востальные добавляли по 0,1 мл надосадочнойжидкости оттестируемых культур и ФГА 2в конечном разведении 1:5000, Планшет инкубировали 18 ч при 37 ОС во влажном воздухе с 5% СО 2, после чего измеряли диаметры зон миграции с помощью штангенциркуля.Средние величины диаметров зон миграции (каждый из трех доноров крови тестировался на лейковзвеси от трех неродственных доноров) приведены в табл. 1,Наименьшие зоны миграции получены 3в лунках с недосадочной жидкостью ФГА.стимулированных клеток, средний % ИМ со 84% в о ь е и 7% в ко е, оингибиции миграции (% ИМ) рассчитывалипо формуле 4% Иу = - х 100(%),Агде А - разность диаметра (средняя из двухлунок) зоны миграции в лунках с ФГА и безФГА; Б -разность диаметра зон миграции 4в лунках с ФГА и надосадочной жидкостьюи в лунках беэ ФГА.Таким образом, надосадочная жидкостьлейкоцитов, стимулированных ФГА, содержит фактор ингибиции миграции лейкоцитов. П р и м е р 2. Иэ периферической крови здоровых доноров выделяли мононуклеарные клетки с помощью центрифугирования на растворе верографии-фиколл. после чего из мононуклеаров выделяли Т-клетки, образующие ранние розетки (рЕ-РОК) и восстановленные розетки (вЕ-РОК) с помощью осаждения соответствующих видов розеток на растворе верографин-фиколл(по известной методике), По 1 х 10 клеток (рЕ- и вЕ- РОК) инкубировали при 37 С в мл среды 199 с 10% АВ-сыворотки в присутствии фитогемагглютинина (Ф ГА-Р, "Дифко" США) в конечном разведении 1:1000 в течение 1 ч, трижды отмывали средой 199 и культивировали в концентрации 1 х 10 кл/мл в среде 199 с 1.0% АВ-сывороткой в течение 18 ч.После инкубации надосадочные жидкости тестировали на активность фактора ингибиции миграции с помощью известногоспособа и предлагаемого способа.Процент ингибиции миграции, измеренный в одних и тех же образцах двумя способами, приведен в табл. 2.Результаты показывают, что для культуральной жидкости как от рЕ-, так и от вЕРОК активность фактора, ингибирующегомиграцию, определяемая двумя способами,не отличается друг от друга,Таким образом, предлагаемый способболее прост по сравнению с прототипом, так как в нем отпадает необходимость работы с капиллярами в стерильных условиях, однако он позволяет оценить продукцию фактора ингибирующего миграцию лейкоцитов с той же точностью,Формула изобретения Способ определения активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов,путем измерения зон миграции лейкоцитовпри инкубации их с исследуемой культу- ральной средой при 37 С не менее 18 ч, о тл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью упрощения способа используют лейкоциты, выделенные в растворе 1%-ного желатина, которые до начала инкубации с культуральной средой помещают в лунки планшета для иммунологических реакций и инкубируют 30 мин при комнатной температуре, а затем30 мин при 4 С,Таблица 11649431 Продолжение табл 1 Таблица 2 Составитель В,СинауридзеТехред М,Моргентал Корректор В,Гирйяк Редактор С,Рекова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1868 Тираж 417 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5