Способ диагностики вирусной инфекции

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НО ПО ЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН ТЕТ СССР И ОТНРЫТИ Д ИИ И ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Н. АВТОРСКОМУ, СВИДЕТЕЛЬСТВУ Щ Ф Й 1. диагностике вир болезней. И 1 раторная диагно риккетсиозных з 1974, с. 28-31 Бюл. У 44олиомиелита и вирАИН СССРанов и В,А.Заклин088;8)ство по лабораторусных и риккетсио965, с. 72-77, Ластика вирусных иаболеваний. М.(54)(57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ путем добавления образца крови больного, содержащего вирус, к культуре ткани с последующим определе нием. цитотоксического действия вируса о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повыпения точности. диагносФ тики, образец крови больного перед добавлением к культуре ткани наносят на фиколл-верографин при градиенте плотности 1,075-1,080 гйсм, далее центрифугируют при 800-100020 - , 30 мин, выделяют лейкоциты и подвергают их бласттрансформации в присутствии фитогемагглютинина.1045Изобретение относится к областимедицинской вирусологии, а именнок способам лабораторной диагностикивирусных инфекций.Известен способ диагностики вирусной инфекции путем добавления образца крови больного, содержащеговирус, в культуру ткани с последующимопределением цитотоксического действия вируса 1 3. 10Однако известный способ недостаточно точен, поскольку при незначительных концентрациях вируса в исследуемом материале обнаружениевируса, а соответственно и диагностика вирусной инфекции затруднительны.Целью изобретения является повышение точности диагностики.Эта цель достигается тем, что по 20способу диагностики вирусной инфекции путем добавления образца кровибольного, содержащего вирус, к культуре ткани с последующим определениемцитотоксического действия вируса, 25образец крови больного перед добавлением к культуре ткани наносят нафиколл-верографин при градиенте плотности 1,075-1,080 г/см, далее центрифугируют при 800-1000 - 20-30 мин,выделяют лейкоциты и подвергают ихбласттрансформации в присутствиифитогемагглютинина (фГА),Способ осуществляется следующимобразом,35Кровь из вены в количестве 5-10 мл вносят в пробирку с 1-2 мл раствора гепарина (10 ед = 0,0077 мг/мл), перемешквают для предотвращения образования сгустка, наносят на градиент 40 фиколл-верографин в соотношении 1 мл крови: 3 мл градиента, центрифугируют при 800-100020-30 мин При этом эритроциты осаждаются на дно центрифужного стакана, в верхней трети градиента образуется плотная опалесцирующая полоса клеток белой крови, состоящая из 75-803 лейкоцитов и макрофагов. Зону градиента, . содержащую лейкоциты, осторожно От бирают пипеткой, разводят в соотношении 1:3 средой 199 на растворе Эрла, центрифугируют при,1000-120(Г5- 8 мин, надосадок сливают, осадок суспендируют в 5,0 мл среды 199 на растворе Эрла и снова центрифугируют . при том же режиме, Отмытые таким образом клетки суспендируют в среде 57 г199 на растворе Эрла с 203 телячьей сыворотки с добавлением фитогемагглютинина в концентрации от 1: 10 до 1:100 :100, вносят в матрасы или пробирки и инкубируют при 37 С 18-24 ч, После инкубации, не переворачивая Флаконы или пробирки, осторожно удаляют среду и добавляют чувствительную культуру клеток на среде 199 на растворе Эрла с 103 телячьей сыворотки, инкубируют при 37 С в течение 3 6 дней. Культуру во флаконах и пробирках ежедневно просматривают на наличие изменений клеточного пласта - цитопатогенного эффекта.П р и м е р 1 . Диагностика вируса Коксаки Виз Форменных элементов белой крови больного с диагнозом хронический клещевой энцефалит.Кровь из вены больного в количестве 5,0 мл вносят в пробирку с 1,0 мл раствора гепарина (10 ед/мл), перемешивают для предотвращения образования сгустка, осторожно наслаивают на градиент фиколл-верограФина, центрифугируют при 800-1000на центрифуге К(Ханс Янецки, ГДР) ,25-30 мин. Эритроциты осаждаются надно центрифужного стакана, в верхней трети градиента образуется полоса клеток белой крови, состоящая на 75-803 из лейкоцитов. Зону градиента отбирают пипеткой, разводят средой 199 на растворе Эрла в соотношении 1:3, перемешивают, центрифугируют при 1000-12005-8 мин, надосадок сливают, осадок разводят в 5,0 мл среды 199 на растворе Хенкса, промывают и центрифугируют при тех же режимах, Осадок суспендируют в среде 199 на растворе Эрла с 207 телячьей сыворотки и фитогемагглютинином с конечной концентрацией 1:100, вносят в матрасы и инкубируют 24 ч при 37 С, После инкубации, не перевораочивая флаконы, осторожно удаляют среду и вносят суспензию клеток перевиваемой линии почек эмбриона свиньи (СПЭВ) - 500 тыс/мл на среде 199 на Эрле с 107 телячьей сыворотки, инкубируют при 37 С 3-4 дня, ежедневно просматривая клеточный пласт на наличие деструктивных изменений, Через 24-36 ч после конфронтации культуры клетов СПЭВ с трансформированными клетками белой крови отмечали слабовыраженные изменения кле457 4 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Заказ 9175/4 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1045 ток, На третий день клетки значительно разрушались. Идентификация методов иммунофлюоресценции и в реакции нейтрализации показала принадлежность выделенного вируса к группе энтеровирусов и позволяет типировать его как Коксаки В,Таким образом, через 3-4 дня после начала изоляции из клеток крови10 был выделен вирус Коксаки В, тогда как при параллельном использовании классического метода выделения вируса из сгустка крови на. культуре ткани15 были получены негативные результаты. П р и м е р 2. Диагностика адено. вируса 1 типа из форменных элементов белой крови больного с проградиентной формой клещевого энцефалита. Кровь из вены в количестве 5,0 мл вносят в пробирки с 1,0 мл раствора гепарина (,10 ед/мл), перемешивают для предотвращения образования сгустка, наносят на градиент фиколл-верографина, центрифугируют при 800-1000 л 25-30 мин. Эритроциты осаждаются на дно центрифужного стакана, в верхней трети гра. диента образуется полоса форменных- элементов белой крови, состоящей из30 лейкоцитов, лимфоцитов и макрофагов. Зону градиента, содержащую белую кровь, осторожно отсасывают, разводят на среде 199 на растворе Эрла в соотношении 1:3, центрифугируют 5 мин при 1000 ., осадок отмывают в среде 199 на растворе Эрла, центрифугируют при 10005 мин и суспендируют в среде 199 на растворе Эрла с 207. телячьей сыворотки и фитогемагглютинина (1:100), вносят в мат 40 расы и инкубируют при 37 С 24 ч.оОсторожно. удаляют среду и вносят суспензию клеток СПЭВ 500 тыс/мл) на среде 199 на Эрла с 103 телячьей сыо45 воротки , инкубируют при 3 С и просматривают под световым микроскопом. На 2-3-й день было обнаружено цитопатогенное действие, которое на 4-5-й день привело к полной деструкции клеточного пласта. Методом им 50 мунофлюоресценции и в реакции нейтрализации показана принадлежность выделенного агента к аденовирусам 1 типа. Повышение точности способа достигается путем выделения форменных элементов белой крови в градиенте плотности фнколл-верографина с последующей концентрацией в 5 раз за счет уменьшения объема исходного образ-.ца крови от 5,0 мл до 1,0 мл. После-,дующее увеличение числа клеток и находящегося в них вирусного агента обеспечивается при бласттрансформации.клеток крови под воздействием Фитогемагглютинина, когда количество клеток увеличивается более чем в2 раза. Общее количество клеток белойкрови увелииивается, таким образом,не менее чем в 10 раз. Одновременно при бласттрансформации активируются .митотические механизмы клетоккрови, которые потенциально стимулируют размножение вирусного агента,при этом соответственно повышаетсяэффективность способа их изоляции.Сепарация клеток крови в градиентеи освобождение от эритроцитов, гемоглобин которых оказывает неблагоприятное воздействие на культуры клеток, обеспечивают полное устранениетоксического эффекта, Последующаяконфронтация чувствительных культурклеток, служащих адапторами вируса,с трансформированными клетками белойкрови обеспечивает эффект чувствительности предлагаемого способа нетолько при выделении вирусных агентов, находящихся в активном состоянии клеток, но и дает возможностьизоляции их в случае тесной связис клеточными структурами или состояния репрессии, открывает возможности и пути обнаружения.и активации агентов, встроенных в геном клетки хо-.зяина. Таким образом, выделение чистой Фракции клеток белой крови, не обладающих токсичностью, с последующей их бласттрансформацией, приводящей к увеличению исходного числа клеток и усиливающей их митотическую активность, позволяет при конфронтации с культурами клеток изолировать вирусные агенты, находящиеся в материалах в малых концентрациях или даже в неактивном, связанном с клеткой зарепрессированном состоянии и тем самым более точно ставить диагноз о наличии вирусной инфекции,