Способ определения жизнеспособности клеток

.В. Гусев нжевого). лето усп а сосожет различияртвых клеивности ихспектральмл), а хим те гии, ц охране ом ь и стабимумов криви овыш х мертвыхакже су том . что ток всмесьи броениикг/мл ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНПРИ ННТ СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК(57) Изобретение относится к области биотехнологии, а также. может быть использовано в медицине, в экологии и охране окружающей среды, в фундаментальной биологии клетки, при контроле за состоянием клеточных культур Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого окрашивание анализируемой суспензии клеток Изобретение относится к бинологии, а именно к контролютаянием клеточных культур, ибыть использована в токсиколотодиагностике и в экологии иокружающей среды (тестированигряэнений на цитотоксичностьЦелью изобретения является-ние точности способа.Изобретение заключается впри окрашивании суспензии клекачестве красителя используютакридинового оранжевого (АО )мистого этидия (БЭ) в соотнош1;3 (напр. 7 мкг/мл АО и 20 м производят смесью красителей акридиновый оранжевый и бромистый этидий в соотношении 1:3, Доли живых и мертвыхклеток регистрируют путем автоматического раздельного подсчета на проточном цитофлуориметре числа тех и других клеток, различающихся по интенсивности свечения (в одном спектральномдиапазоне), Повышение точности способа достигается в результате устранения перекрывания областей распределения (по интенсивности свечения) двухтипов клеток, снижение трудоемкостианализа и его удешевление - за счетпоявления возможности применения более простых в эксплуатации отечественных регистрирующего устройства(однаканального проточного цитофлуориметра) и красителя (акридинового БЭ для концентраций зий (05-3) 10 кл/ в флуоресценции живь ток регистрируют по свечения в одном и нам диапазоне. Это позволяет ра зировать положени х распределения жи клеток на гистаграмзить область распределения живых кле ток примерно в 3-4 раза по сравнению с прототипом (не меняя общей площади под кривой распределения), и таким образом полностью исключить основнойисточник ошибки анализа - перекрывание областей распределения двух типов клеток, Регистрация различий поинтенсивности фпуорвсценции позволяет 5заменить дорогостоящееимпортное оборудование на отечественное, а применение более простой в эксплуатациисмеси красителей (АО вместо флуоресцеиндиацетата ФДА) снижает трудовм- Окость способа и дает возможность использовать более доступный отечественный реактив,В этой смеси широко используемыйкраситель АО проявляет новое свойство - способность окрашивать живые имертвые клетки таким образом, что ониотличаются друг от друга не толькоразным цветом свечения, но и интенсивностью этого разноцветного свечения. рЭто дает возможность регистрироватьдифференциацию живых и мертвых клетокодним Фотоэлектронным детектором водной полосе флуорвсценции, применивдля этоо дкный прточнйцитофлуориметр. Такая регистрацияобеспечивает автоматизацию процессаанализа, объективность результатов и,как следствие этого, болев высокуюточность, а также быстроту их получения.П р и м е р 1. К 1 мл каждой из10 идентичных проб анализируемой суспензии лимфоцитов человека фракциюмононуклеарных клеток выделяют из35крови здоровых доноров с помощьюцентрифугирования),в среде 199 ( концентрация 1,2 106 кл/мл ) добавляют20 мкл раствора бромистого этидия1 концентрация 1 мг/мл/ и 7 мкл раст"вора акридинового оранжевого (концентрация 1 мг/мл ). Перемешивают и инкубируют 20 мин при 20 С. Далее пробыанализируют на проточном цитометре.Получают 10 сходных гистограмм. Анализ гистограмм дал результат: живыхклеток 92+3%. одновременно те же окрашенные 10 проб анализируют под микроскопом (объектив 400,65) традиционным методом, Получают Результат: живых клеток 84,5+ 6,5%.Время, затраченное непосредственнона анализ методом проточной цитометрии, составляет 25 мин.для 1 О проб,в то время как для проведения ана%55лиза тех же 10 проб традиционным методом микроскопии потребовалось 2 ч.При этом средняя величина второгорезультата несколько меньше, чвм первого. Это снижение происходит эасчет гибели части клеток в процессе их подсчета под микроскопом.Таким образом,.способ позволяетс меньшей статистической и систематической погрешностью и за меньшее время определять соотношение живых имертвых клеток животных по сравнениюс традиционным методом анализа клетокпод микроскопом.П р и м е р 2. Отбирают 1 мл суспензии клеток тимуса мыши в раствореверсенаконцентрация 2 1 О кл/мл),добавляют 20 мкл раствора БЭ концентрация 1 мг/мл )и 7 мкл раствора АО(концентрация 1 мг/мл ), перемешивают,инкубируют 20 мин при 20 С, анализируют 0,5 мл пробы на проточном цитоФлуориметре. В канале возбуждения -светофильтр СС - 15-4, в канале регистрации - светофильтр ОСи "зеленая" светоделительная пластинка из набора микроскопа ЛЮМАМ И 1. Регистрируют гистограмму и количество клеток влевом (9 1010кл ) и правом (9 576 лк 10 кл ) пиках. Число клеток в пикепропорционально площади под соответствующей кривой в пределах визуальновыбранных границ по оси абсцисс и подсчитывается автоматически с помощьюанализатора импульсов, входящего всостав проточного цитофлуориметра. Получают результат: живых клеток 91,32%,мертвых клеток 8,68%, Параллельнос анализом на цитофлуориметре доли живых и мертвых клеток в той же окрашенной пробе подсчитывают с помощью камеры Горяева под люминесцентным микроскопом, что требует значительно больше времени и труда. Результаты этогоанализа (9,1%+0,5+ мертвых клеток/не отличаются от результатов анализапробы на проточном цитофлуориметрев пределах 5% по относительной величине.П р и м е р 3. К 1 мл пробы из анализируемой суспензии клеток тимусамыши в растворе версена (концентрация1,5 1 О кл/мл) добавляют 20 мкл раствора БЭ (концентрация 1 мг/мл) и 7 мклраствора АО (концентрация 1 мг/мл),перемешивают и инкубируют 20 мин при20 С. Анализируют 0,5 мп пробы наодноканальном проточном цитофлуориметре, как описано в примере 2, Регистрируют гистограмму и определяют соотношение живых (88,3%) и мертвых (1,7%) клетокЗаказ 2906 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раугпская наб ц. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгрод, ул. Гагарина,101 5 15Одновременно к 1 мп другой пробы и этой же анализируемой суспензии добавляют 50 мкл раствора ФДА, концент" рация 10 мкг/мп, и 10 мкл раствора БЭ перемешивают и инкубируют 25 мин при 20 фС. Анализируют 0,5 мп этой пробы на проточном цитофпуориметре. Регистрируют соответствующую гистограмму, но соотношение живых и мертвых клеток нельзя определить из-эа невозможности точно определить область распределения мертвых клеток.Кроме того, к 1 мп третьей пробы иэ той же анализируемой суспензии добавляют 20 мкл раствора АО, перемешивают и инкубируют 20 мин при 20 С. Анализируют 0,5 мл этой пробы на проточном цитофпуориметре, как описано вьппе. Регистрируют соответствующую гистограмму, но соотношение живых и мертвых клеток нельзя определить иэ-эа перекрывания областей распределения живых и мертвых клеток,Результаты сравнительного анализа всех трех зарегистрированных гистограмм показывают, что только в случае окраски клеток смесью красителей БЭ и АО области распределения живых и мертвых клеток хорошо разделяются, что дает возможность с высокой точ" ностью определить в этом случае соотношение тех и других клеток в суспензии. При окраске клеток одним краси". .телем АО живые и мертвые клетки не разделяются по интенсивности их люминесценции. Известная окраска клеток смесью красителей ФДА и БЭ также не дает возможности разделять живые и 96247 6э мертвые клетки при одноканальной регистрации.Таким образом, при использованичспособа существенно повышается точность измерения при снижении трудоемкости анализа и его удешевление эасчет появления возможности примененияотечественных регистрирующего устройства и красителей. Кроме того, способдает возможность определять соотношение живых и мертвых клеток неавтоматиэированным способом - подсчетом клеток при наблюдении под люминесцентным 15 микроскопом (в случае отсутствия проточного цитофлуориметра),Формула и э о б р е т е н и яСпособ определения жизнеспособности 20 клеток, включающий получение суспензниклеток в солевом растворе, обработкусуспензии раствором этидиума бромидав смеси с фпуорохромом, возбуждениефлуоресценции в синей области спектра 25 с последующей регистрацией фпуоресценции и количественной оценкой живыхи мертвых клеток по гистрограмме распределения, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повьппения точности, 3 О суспенэию клеток получают с концентрацией (0,5-5) 10 кл/мл, этидиум бромидиспользуют в смеси с акрндиновым оранжевым в количестве 20 и 7 мкг/мл соответственно, флуоресценцию регистЗ 5 рируют в спектральном диапазоне 520700 нм, а оценку осуществляют на гистограмме распределения клеток по интенсивности флуоресценции в этомспектральном диапазоне.