Способ исследования кинетики взаимодействия компонентов раствора

ц 469938 Союз Советских Социалистических Республик) Ч. Кл, С 01 п 23/20 присоединением заявк; Государственный камит Совета Министров ССС 32) П итет овано 05,05.75. Бюллетень М 1убликования описания 10,02.76 Опубли 53) УДК 543.52:543.9(088,8) бретентий по делам и откр Дата(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕ КИНЕТИКИОВ РАСТВОР НН- : Н - ДНК учае разделения расразчичной забцтьнов пределе каждойя модцфццирующеДНК) система услварианте, когда од(например, фаза 1)равновесие с добавликаторных молекул творнтеля ца две стью а томов вофазы (например, му возцснст, ью ожцястся. В проа из фаз раствопрцходцт в цзояемым кол цчсст фазы с дорода благодар молекул стейшем рителя тонное вом цнд"О,НОп (2) различныеметка в х объемов, ц 1 1(. К, тоН - ДНК (2) далекасицжс це до коццсцным. исходит(2) я кицеН 1,Изобретение относится к способам исследования свойств растворов биополимеров и может быть использовано в молекулярной биологии, биофизике и биохимии в тех случаях, когда необходимо обнаружить и количествец цо оценить аномалии подвижности и надмолекулярной организации в одних компонентах раствора, возникающих вследствие модифицирующего влияния других.Известен способ обнаружения аномального 10 состояния растворителя в растворе ДНК, основанный ца изучении кинетики прямого изотопного водородного обмена между водой и молекулами ДНК. Согласно этому способу, экстремальный характер кинетической кри вой обмена свидетельствует о наличии в растворе взятого биополи мер а дополнительной фазы воды с ограниченной способностью к водородному обмену. Это утверждение основывается на следующих модельных представлениях: если растворитель представляет собой единую фазу, т. е, состоит из молекул воды (ННО), способных обменивать свой водород с обменоспособным водородом ДНК (Н - ДНК) только с единой скоростью, то, согласно молекулярно-статистической природе водородного обмена, кинетика прямого включения меченого водорода Н ф из растворителя в ДНК может быть только монотонной: 30 существенно затруднен, возникают условия для прямого включения Н - ДНК, находящихся в предела занимаемых этими фазамп. Так, ес после быстрого накопления метки в период времени, когда реакция от изотопцого равновесия, следует концентрации метки в Н - Д 1-1 К траций, соответствующих равновес Включение метки в Н - ДНКц пр монотонно по мере приближения реа к изотопцому равновесию. Суммарн тика включения метки в (Н -+Н - ДНКн), таким образом, обнаруживаетотклонения от монотонности, характер которых зависит от конкретных условий. Недостатком известного способа обнаружения модифицирующего влияния молекул ДНК на состояние воды является то, что эти модельные представления, положенные в его основу, могут быть оспорены. Так, например, можно допустить, что растворитель нс испытывает модифицирующего влияния со стороны макромолекул и представляет собой единую фазу, а немонотонная форма кинетики прямого водородного обмена, полученная в эксперименте, целиком является следствием происходящих в молекулах ДНК периодических синфазных в макрообъеме раствора конфармационных изменений, существование которых в настоящее время доказано для некоторых других молекул биополпмеров, находящихся в растворимом состоянии,Цель изобретения - повышение воспроизводительности результатов способа обнаружения аномалий подвижности растворителя в растворе биополимера, основанного на определении кинетики прямого водородного изо топного обмена между растворителем и растворенными молекулами,Согласно изобретению, поставленная цель достигается тем, что в исследуемый раствор, состоящий из воды и растворенных в ней молекул ДНК, заранее вводят третий компонент - низкомолекулярное по сравнению с ДНК вещество Р - Н, содержащее обменоспособный водород.,При этом количество обменоспособного водорода должно быть много больше, чем количество обменоспособного водорода ДНК (первое условие); скорость его обмена с водородом окружающей воды должна быть соизмерима со скоростью обмена водорода между молекулами самого растворителя, не содержащего растворенных веществ (второе условие). В такой системе третий компонент выполняет функции опосредственного свидетеля состояния растворителя. Так, кинетика прямого включения меченого водорода из растворителя в обменоспособный водород органики будет складываться из двух процессов; НН"О, Н - ДНК (3) ННОГО Н - К (4)Согласно первому условию, измеряемая в эксперименте кинетика включения изотопа из растворителя в растворимые вещества будет целиком определяться уравнением (4). Если в системе растворитель не подвергается модифицирующему влиянию ДНК и представляет собой единую фазу, то в силу молекулярно-статистической природы водородного обмена будет наблюдаться монотонная кинети 20 25 30 35 40 45 50 ка прямого изотопного водородного обмена из растворителя в вещество - свидетель.Если в системе существуют две фазы растворителя, то равномерно распределенное в обоих фазах вещество - свидетель будет накапливать изотоп в различных условиях. Так, согласно второму условию, задолго до наступления равновесия в реакции (2) произойдет накопление метки в Н - Кь которос посте пенно сменится исчезновением ее до уровня равновесных значений реакции (2) по мере достижения изотопного равновесия в ней. В то же время в аномальной фазе 11 растворителя включение метки в Н - Кн будет осуществляться монотонно по мере накопления метки в этой фазе. В результате суммарная кинетика будет немонотонной, однако теперь такое отклонение невозможно трактовать с позиций конфармационной подвижности молекул ДНК и надежность вывода о наличии именно модифицирующего влияния ДНК на растворитель становится абсолютной.Способ был реализован с раствором ДНЕ (м. в. = 1 10 дальтон) при концентрации 500 мкг/мл. В качестве метки использовался тритий,в виде НТО при концентрации 0 мкюри/мл. Веществом - свидетелем служил цитрат натрия в концентрации 0,04 М. Началом реакции обмена служило соединение 0,01 мл раствора НТО в 0,15 М КаСи 0,04 М цитрата натрия и 0,1 мл раствора ДНК в в 0,15 М ХаС и 0,04 М цитрата натрия. Обмен происходил при комнатной температуре, остановка его осуществлялась за. мор аживанием образцов при температуре жидкого азота. Лиофилизация осуществлялась в два этапа: при - 30 С в течение 6 час, затем при постепенном подъеме температуры до 45 С в течение 8 час. Измерение образцов производилось на двухканальном жидкостном сцинтилляционном счетчике Р 1- с(ег - Хцс 1 еаг со сцинтиллятором обычного состава (3 г РРО + 0,3 г РОРОР+100 г нафталина на 1 л диоксана) при эффективности 30.Вид кинетики включения трития в цитрат натрия показан на чертеже. Форма этой кинетики свидетельствует о наличии в растворе фазы воды с ограниченной способностью к водородному обмену. Предлагаемый способ может быть полезен не только при обнаружении модифицирующего влияния растворенного биополимера на растворитель, Он может быть использован, например, для обнаружения взаимодействия биополимера с самим веществом - свидетелем с целью оценки характера этого взаимодействия, В этом случае должна меняться кинетическая характеристика кривой включения метки в Р - Н в присутствии биополимера.Подпишгосв СССР Изд, М 8 Государственного по делам из Москва, Ж, 2комитетаобретенииРаушская каз 1289/1848ЦНИИП Тираж 902Совета Минпстоткрытииаб., д. 4/5 ип. Харьк. фил. пред. Патент. 1, Способ исследования кинетики взаимодействия компонентов раствора биополимера, например, молекул ДНК путем прямого изотопного водородного оомена между растворителем и растворенным веществом, от гггчагошиася тем, что, с целью повышения воспроизводимости результатов, в раствор биополимера Е,О 3 фсО,б ф О,ц вводят низкомолекулярное вещество, например, цитрат натрия, имеющее большее по сравненгио с биополимером, количество водорода со скоростью его обмена в растворе, соизмеримой со скоростью обмена водорода в свободном растворителе. 2. Способ по и. 1, отличаюигийся тем, чтоцптрат натрия берут в концентрации 0,04 М.