Способ быстрого определения числа спермиев в пробе

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 09) (11) 575931 А 61 Э 19/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ и точности способа,абатывают йодистым п Пр водительнобу спермыднем, зат с пи вац или нистафлуоресцерацию спения: С =Ыгде Г,вора йодиспермы иного раст, Ша айош ССР 985. НИЯ ЧИ стсапонина;вора; Г -и спермы;умножениемвочной кри ьско кусстелью: б ного роизцентрациеи 5 мг/мл, интенсивность (Г) .4. Изготовляют п ную смесь без пробы раствора йодистого фосфатного буферног (рЬозрйасе ЬиНег з спиртового раствора ряют интенсивность пробы Гз. снова измер араллель ную еперь: 160 пропидия, 40 о раствора РВ а 11.пе) и 40 мл дигитонина. флуоресценциияют интеаствора нсивность(Г ).уфер номуого разбав яют астворуленной рител а изм ивност спер мь(Гу) . ют инт из еренных и ить проце дующим об На. осно тей мож енных кл ачемл.кон-,о вычиелеток сл т живыхазом. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 1(71) Иннофинанце алталанош ипензинтезет (НП)(54) СПОСОБ БЫСТРОГО ОПРЕДЕЛЕЛА СПЕРМИЕВ В ПРОБЕ(57) Изобретение относится кму хозяйству, в частности к ивенному осеменению животных.изобретения является повышени Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных.Цель изобретения - повышение произ водительности и точности способа.П р и м е р. Количество живых сперй определяют следующим образом.1. Интенсивность Флуоресценции (Г), растворенного в буферном растворе йодистого пропидия (РЛ, измеряют на 1600 мп раствора красителя с концентрацией 25 мг/л, эта величина служит одновременно стандартом.2, В раствор добавляют предварительно разбавленную в 40 л буферного Раствора пробу спермы и снова измеряют интенсивность(Г,) .3, Затем добавляют к пробе в к стве реактивами проницаемости 40 спиртового раствора дигитонина с ем дигитонином или сапонином тином, проводят регистрацию нции на флуориметре. Концентрмы определяют из соотноше- Г -Г ) -(Г -Г ) /Г, млн/ммэ, Алуоресценция буферного расттого пропидия;Г - то же, сапонйна; Гз - то .же, буферора йодистого пропидия и Г,) - то же, буферного рато же, буферного раствора с - коэффициент, полученныйтангенса крутизны калибровой на степень предваритель- с вления спермы.(Г -Г )-(Г -Г )2 3 7 ФОбщее число спермий можно определить из одинаковых величин интенсивности, так как разность между Г и Г,7величина (Г -Г ) образуется ат всехимеющих проницаемость клеток. Величина (Г -Г ) показывает в области 1 х 10 101,5 х 10 клеток/см линейную зависимость от конценграпии клеток. В зтойобласти из величины Г -Г можно определять при помощи калибровочной кривой число клеток в пробе, 15И в этом случае следует приниматьв расчет неспецифическое вызванноеЮпермиями повышение интенсивности(ГГ 5) - (Г-Г ),г- г,це О/- каэффицк-.йнт, полученный умножением тангенсакрутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления 25спермы. Калибровочная кривая может сниматьСя в цитаметре потока на маркированных йодистым пропидием пробах спермы .и,ЭСледующим образом.,Исследуемую суспензию клеток разбавляют буферным раствором РВБ даконцентрации 0,5-2 х 10клеток/мл;1 млэтой суспензии охлаждают во льду кразбавляют 1 мл 17-нага раствора КР -40 (раствор Нонидет Р,.изготовитель: Сигма Хеми ГмбХ, ДяйзенхофенфРГ) . В результате обработки убываютвсе клетки, их клеточные оболочки .:Ястановятся праницаемыми для йодисто-.го пропидия.Затем добавляют к пробе такое количество растворенного в буферномрастворе РВИ йодистого прапидия, что-,бы конечная концентрация составляла30 мг/мл.Окрашенную пробу анализируют в цк.-тометре потока, например в цитометрсБектона-Дикансона типа. ГАСЯ 111, саИ9скоростью потока 1500 клеток/с, Возбуждение происходит при помощи арговионнаго лазера при длине волныч 88 нм, амиссию регистрируют в области длины волны выше 620 нм прк проме-55жуточном включении проницаемого вверх "режущего фильтра.Во время анализа протекающие мимсклетки считает прибор на основании интенсивности флуоресценции, а так как клетки благодаря обр.ботке все становились проницаемыми и все поглощали краситель, подсчитанное число соответствует абсолютному числу кле-. ток, Точным определением израсходованного количества пробы, учитывая коэффициент разбавления, получают первоначальную концентрапию клеток пробы. Зта концентрация должна соответствовать величине, измеренной на спектрофлуориметре для одинаковой пробы(Г,-Г,) - (Г,Г д о Из пробы изготовляют ряд разбавленкй и в результате серии цитаметрических и спектрофлуориметрических измерений в различных областях концентраций определяют абсолютные количества клетак, принадлежащие к измеренным на спектрофлуариметре коэффициентам ичтенсивности, Точность этих величингарантируется многократно повторенными измерениями, уак как величина коэффициента интенсивности изменяется линейно с изменением концентрации клеток, ,можно для каждого исследованного вида спермы построить прямую, на основаник которой можно определкть принадлежащие к измеренным коэффициентам интенсивности количестваклеток.Умножением тянгенса крутизны (тангенся угля наклоня) калибровочной кривой на степень газбавления пробы спермы получают коэффициент . Последний, умноженный ня измеренный коэффициент интенсивности,. дает непосредственна концентрацию клеток пробы.формула и з о б г е т е н и яСпособ быстрого определения числа спермиев в пробе, включающий обработку клеток веществом придаюшим прачицаемость оболочке клетки, и растворам флуоресцентного красителя в буфере с последующей регистрацией Йлуоресценции к определением числа клеток в пробе, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения производительности и точности способа в качестве флуоресцентного красителя используют йодистый пропиций, в качестве вещества придающего проницаемость оболочке клетки, - сапанин или дигитонин, или нистятин, обработку клетокСоставитель И.МарченкоТехред М,Дидык Корректор О.Цинле Редактор А.Долинич Заказ 1793 Тираж 462 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 5 157593 ведут вначале йодистым пропидием, а затем сапонином или дигитонином, нли нистатином, регистрацию флуоресценции проводят на фотоэлектронной уста 5 новке, причем отдельно измеряют флуоресценцию буферного раствора йодистого пропидия (Г ), буферного раствора йодистого пропидия и спермы (Г), буферного раствора йодистого пропидия, 10 спермы и сапонина (Р ), буФерного раствора йодистого пропидия и сапонина (Г ), буферного раствора (Р), буФерного раствора и спермы (Р), концент 1 брацию С спермы определяют из соотношенияС:(Р"-"-("-Р /ммз где с - коэААнциент, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степеньпредварительного разбавленияспермы,а количество М живых клеток - из соотношения