Способ идентификации ингибиторов гидролаз

и па ение при 8вновьют. ение и повыности способа в отдельных уя л ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Авторское свидетельство СССРВ 1175967, кл. С 12 0 1/40, 1985,(57) Изобретение относится к энзимологиии биотехнологии и может использоваться вбиохимии растений и животных, в частностив работах по биохимии иммунитета расте-ний к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификацииингибиторов индивидуальных компонентовсложных смесей гидролаз. Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности способа Изобретение относится к знэимологии и биотехнологии и может быть использовано в биохимии растений,и животных, в частности в работах по биохимии иммунитета растений к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификации ингибиторов индивидуальных компонентов сложных смесей гидролаз.Цель изобретения - упрощшение разрешающей способидентификации ингибмторокомпонентов смесей гидрелаэ,и.зало 1648979 А 1(5)5 С 12 0 1/40 идентификации ингибиторов отдельных компонентов смесей гидролаз. На пластины гелей наносят препараты, содержащие ингибиторы и гидролазы, и проводят их раздельное фракционирование зле ктрофорезом, изофокусированием или другими методами, после чего обеспечивают условия для перекрестного взаимодействия компонентов спектров ингибиторов и гидролаз. Для этого накладывают один гель на другой или последовательно снимают реплики с гелей таким образом, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаэ пересекались под прямым углом. В результате диффузии компонентов иэ геля в гель происходит их пространственное совмещение в точках пересечения, Это делает возможным биохимическое взаимодействие компонентов ингибиторов и гидролаз. В гелях или репликах выявляют компоненты гидролаз по активности, В точках пересечения компонентов гидролаэы с их специфичными ингибиторами полосы ферментов сужаются или прерываются. 2 з.п, ф-лы. р и м е р 1, Идентификация белков пшеницы - ингибиторов компонентов илаз насекомых.лки-ингибиторы извлекают из 1 г муеницы 2-кратным обьемом воды в те 1 ч, Смесь центрифугируют, евают надосадочную жидкость 10 мин 0 С для инактивации ф - амилаэ и центрифугируют, осадок отбрасываАмилаэы извлекают, гомогенизиннки зернового точильщика-амилаз зернового точильщика ингибируются сходными компонентами белков зернапшеницы,П р и м е р 2, Идентификация ингибиторов компонентов а-амилазы прорастающего зерна пшеницы.Фракцию белков, содержащую ингибиторы, экстрагируют из 10 г муки пшеницы2-кратным обьемом воды, После центрифугирования методом аффинной хроматограФии на субтилизин-сефарозе очищаютбифункциональные ингибиторы а -амилазы/субтилизина, а -Амилазы зкстрагируют5-кратным объемом 0,1-ного СаС 2 из прораставших в течение 3 дней при 22 С изатем высушенных и размолотых зеренпшеницы, Экстракт прогревают 5 мин при71 С для инактивации а - амилаэ.Полимеризуют два 6";ь ПААГ, содержащих 2амфолин, рН 5 - 8, для фракционирования ингибиторов и 2 сервалитов, рН3-10, для а -амилаз. Гель для а -амилазполимеризуют на подложке.Ингибиторы (200 мкг/мл) наносят с помощью бумажной полоски 5 х 80 мм, которуюнакладывают на гель в 20 мм от анода параллельно электродным полоскам,Раствор а -амилазы разбавляют в 5 раэи наносят полоской 10 х 80 мм в 50 мм отанода. После изофокусирования часть геляна подложке со спектром а- амилаз выреВбугорегйа Ооаиса Г, с 4-кратным объемом 0,1-ного СаС 2.Полимеризуют два 6 ПААГ, толщиной 0,2 мм, содержащие 2 амфолин, рН 5-8 для ингибиторов, и 2 ь сервалитов, рН 3-7 для а -амилаз,Ингибиторы и а -амилазы наносят на гели с помощью полосок фильтровальной бумаги 10 х 100 мм. Проводят изофокусирование на приборе при расстоянии между электродами 100 мм, Готовят 6;(, ПААГ-реплику толщиной 0,2 мм на подложке, содержащей 0,1 М йа-ацетатный буФер, рН 5, и 0,4-ный крахмал. После изофокусирования реплику накладывают на гель с ингибиторами на 10 мин, затем ее переносят на гель с а -амилазами так, чтобы компоненты белков-ингибиторов и а -амилаз пересекались под прямым углом, и инкубируют 30 мин при 37 С,Реплику помещают в раствор иода (1 г 32 и 5 г КЗ на 1 л воды). Компоненты а -амилаз проявляются в виде прозрачных полос на синем фоне. 8 зонах пересечения компонентов а -амилаз и их ингибиторов линии а-амилаэ сужаются илипрерываются. Все основные компоненты а 5 10 15 20 25 зают и накладывают на гель, на котором разделялись ингибиторы, так, чтобы угол междулиниями компонентов белков и а-амилаз составлял 90 О, Через 30 мин гели разъединяют и на них накладывают эаполимеризованные на подложке гели-реплики, содержащие 0,1 М чаН 2 РО 4 и 0,4-ный крахмал, и инкубируют при 37 С 30 мин. Реплики погружают в раствор иода. В зонах пересечения со специфичным компонентом ингибиторов компоненты а - амилаз прерываются,Формула изобретения 1. Способ идентификации ингибиторов гидролаэ, включающий раздельную экстракцию гидролаэ и их ингибиторов из исходного сырья, Фракционирование ингибиторов гидролаз в пластинах геля, пространственное совмещение геля, содержащего спектр ингибиторов гидролаз, с гелем, содержащим ферменты класса гидролаз, в присутствии субстрата реакции, с последующим определением активности гидролаз в зонах их пересечения с ингибиторами и идентификацией ингибиторов гидролаз по активности гидролаз, о т л и ч а ющ и й с я тем, что. с целью упрощения и повышения разрешающей способности способа, полученный экстракт гидролаз непосредственно фракционируют в пластинах геля и полученные пластины, содержащие спектр гидролаэ, используют для пространственного совмещения с гелем, содержащим спектр ингибиторов гидролаз.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что совмещение спектров ингибиторов и гидролаз осуществляют путем наложения геля, содержащего спектр ингибиторов, на гель, содержащий спектр гидролаз, так, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаз пересекались под прямым углом, затем пластины гелей разъединяют и на каждый из них накладывают гель, содержащий субстрат реакции,3. Способ пои. 1, отл ич а ю щи йс я тем, что совмещение спектров ингибиторов и гидролаз осуществляют путем последовательного наложения геля, содержащего субстрат реакции, на гель, содержащий ингибиторы, и затем на гель, содержащий гидролазы, так, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаэ в геле, содержащем субстрат реакции, пересекались под прямым углом.