Способ определения количества розеткообразующих клеток

)4 СО ТЕТ СССРи отнРытии ОСУДАРСТВЕННЫЙПОДЕЛАМ ИЗОБРЕТ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ атем О-кратдистиллиров ный р-р Хен 200 е 5 мин, 199, ставят ния икси анную Воду у з кса, центрифук осадку доб реакции розеф руют клетки фо ферным р-ром, содержащим формальдегида. Глутаровь добавляют в конечный кон 0,2%. На пластмассовую носят слой белка, фиксир танолом, на эту пластину зок, также фиксированный окрашивают препарат и по клетки,-50 ВА н е ю 3 Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСРОЗЕТКООБРАЗУИЦИХ КЛЕТОК(57) Изобретение относится к иммулогии. Цель изобретения " повышточности и упрощение способа. Ллэтого эритроциты пробы крови изца лизируют, добавляя на 0,5 ми гируют при авляют среду ткообразовасфатным бу,0-2,5% Й альдегид центрат 0,15- пластину наованный менаносят маметанолом, дсчитывают1 1439Изобретение относится к иммуноло гии.Цель изобретения - позьппение точности, упрощение способа.Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1. Забирали иэ пальпа0,3 мл крови. Эритроциты лизировалипутем добавления 9 мл дистиллированной воды на ЗО с, затем добавляли1 мл 10-кратного раствора Хенкса.Центрифугировали при 200 е 5 мин,затем осадочную жидкОсть слизали косадку добавляли 0,4 мп среды 199 ьВ лунки планшета для иммунологических реакций зализали по 0,05 мл полученной суспензии клеток, затем пс0,05 мл 1%-нои суспензии эритроцитозбарана или эритроцитов мьпни или клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием. Планшет закрывали крьппксй ицентрифугировали при 2008 в течение5 мин, Инкубировали при 4 С з течениеЗО ьялн. Затем в каждую лунку планшета приливали jо 0,5 мл раствора, со, держащего 0,15 мп глутаровсго альдегида и 2% Формальдегида на Фосфатномбуфере (рН 7,4). Выдерживали при комнатной температуре 5 мин, после чего надосадочную жидкость стряхивали,добавляли 0,1 мп дистиллированнойводы осадок ресуспендировапи и делали мазки размером 0,8%0,8 см, Дпя мазка брали 0,025 мл полученной суспензии,Мазки делали на крьппке планшетаподготовленной следующим образомНа поверхность крьппки наносили тонкий прозрачный слой сыворотки при4 Опомощи марлевого тампона. Сывороткувысушивали на воздухе, затем Фиксировали метанолом - к поверхнос.и крьпп. ки плотно прикладывали лист Фильт"ровапьной бумаги размером 8"10 см,который пропитывали метанолом (1,5 мл),сверху накладывали полиэтиленовую;.пленку такого же размера для умень"шезия испарения метанола и выдерживали в течение 10 мин. Такой лист бумаги с полиэтиленовой пленкой можнохранить в герметичной посуде и ис-"пользовать несколько раз. Крьппку сфиксированным слоем белка высушивалиот метанола и наносили сетку в ви 55де квадратов размером 0,90,9 см(всего 80 квадратов) при помощи линейки и острого поедмета (например,скальпеля илн иглы). Пластина, подгстозленная таким способом, может храниться при комнатной температуре не менее 2 мес. При помощи острого предмета можно написать на пластине всю необхсцимую инФормацию.Маяки зь 1 сушизали на воздухе и Фиксировали метанолом тем же способом, как слой белка, нанесенный на пластинуьПосле высушивания пластину накрывали листом Фильтровальной бумаги размером 810 см, пропитанным раствором метилового зеленого пиронина (1,5 мл краскл), сверху накладь,вали лист полиэтиленовой пленки такого же размераь Выдерживали 20 :плнь Такой лист бумаги с полиэтиленовой пленкой пропитанный раствором краски, можно хранить з герметично закрьггой посуде и использояать несколько раэ.Окрашенный препарат высушивали на воздухе Затем на поверхность капали 10-12 капель иммерсионнсго масла (в общей сложности 1 мл), накрывали прозрачной целлофановой пленкой размером 810 см, пленку разравнивали при помощи тампона из марли так. чтобы под ней не Остакалось пузырьков воздуха. Препарат готов к микрсскспирозанию.П р и м е р 2. В каждую лунку планшета, содержащего осадок розеток и клеток, полученный так, как описано з примере 1, приливали по 005 мл раствора, содержащего 0,20 мп глутаро зого альдегида и 2,5% Формальдегида на Фосфатном буфере (рН /.4).Выдерживали нр 1 л комнатной температуре 5 ылн, затем надосадочную жидкость стряхивали, осадок ресуспендировали и делали мазки размером 0,8 ьь 0,8 см из 0,025 мл полученной суспенэии, 11 азки делали на крышке планшета для иммунологических реакций, подготовленной так же, как описано з примере 1. Все остальные операции делали так же, как в примере 1, с той лишь разницей, что з качестве белка испольэовали белок яйца.Предлагаемьал способ позволяет существенно повысить точность опрецеления количества розеткообраэующихклеток, поскольку мазок на пластмассу,покрытую слоем белка, ложится ровно,.без конгломератов, а дозированноеколичество суспензии клеток при четко ограниченной площади мазка (0,8 ""0,8 см) позволяет получать мазкиодинаковой тсглины,Способ определения количества розет" ксобразующих клеток, включающий постановку реакции розеткообраэования, Фиксацию клеток фосфатным буферным раствором, содержащим глутаровый альдегид, приготозление мазков, их окрашивание и подсчет клеток, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью по вышения точности и упрощения способа, Фиксацию клеток осуществляют раствором, дополнительно содержащим 2,0- 2,5 И Формальдегида, глутаровый альдегид добавляют в конечный концентрат 0,15-0,27, а мазки готовят на пластмассовой пластине с предваритель" но нанесенным слоем белка, фиксирован" ным метанолом,ФВ 1111 П"1 Заказ 6071/44 Тираж 847 Подписное Ужгород, ул. Проектная, 4 Г 1 ронзн.-полигр. пр - тие, г. 3 14 ч 5Предлагаемый способ позволяет получать мазок более однородный, чемизвестный, что выражается в догтозерном (Р 0,001) и существенном (вГсреднем в 5,6 паза) уменьшении количества выявленных конгломератов.Увеличение однородности мазка приводит к повышению точности получаемыхрезультатов, поскольку просчет позеток в конгломератах приводит к получению искаженных результатов,Повышение точности результатов попредлагаемому способу в сравнении сизвестным выражается в уменьшении 15разности между максимальным и минимальным значениями Е-РОК, полученными в результате просчета трех случайно выбранных полей одного и того жепрепарата, а также вследствие этого 20уменьшения среднеквадратической ошибки ш (в 1,28-8,4 раза) просчета трехслучайно выбранных полей одного итого же препарата, Кроме того,предлагаемый способ приготовления препаратов имеет большие преимущества посравнению с известным и з затратахтруда и материалов.Затраты материалов, необходимыепри реализации предлагаемого способа, ЗОзначительно меньше, чем затраты материалов в результате приготовленияпрепаратов по известному (базовому)способу, в предлагаемом способе вместо предметных и дефицитных покровныхстекол применяется крышка планшета,которую ранее выбрасывали после ис"пользования планшета, и целлофановая пленка, которая дешева и доступна, Кроме того, имеется экономия , 40растворителей, краски, отпадает необходимость наличия станка для шлиФовки стекол, Существенное значениеимеет уменьшение количества глутарового ачьдегида, который является 45токсичным веществом.Испольэование предлагаемого способа требует значительно меньше растворителей, в частности метанола., нетребует этанола, диэтилового эфираи ксилола (необходимого для растворения канадского бальзама), что самопо себе представляет не только экономию, но и улучшение условий трудавследствие уменьшения контакта работающего с растворителями.В предложенном с собе уменьшается количестве используемого глутарового альдегида в 5-20 раз, что такжедает экономию дефицитного реактиваи сушественно улучшает условия труда,госкольку глутароный альдегид является ядовитым, летучим веществом.Замена основной части глутаровогоальдегида не представляет трудностейпоскольку Фомачьдегид широко доступен так как Формалин широко используют в гистологии, и пары формальдегица нетоксичны,Улучшение условий труда в предлагаемом способе состоит также в отсутствии необходимости шлифовки стеколдля нанесения на них надписей(в результате чего образуется стекляннаяпыль, проникающая в легкие), таккак надпись на пластмассе легко сделать острым предметом,Затраты труда. на осуществлениепредлагаемого способа меньше, чемна осуществление известного. При обследовании 100 человек манипуляцией с5 крышками планшеток и 5 прямоуголь"никами целлофанэ меньше, чем с 200предметными и 400 покровньии стекламиКроме того, при использовании крышекпланшетов пслностью исключается необходимость мытья, шлифовки и обезжиривания большого количества стекол.Все это сокращает время приготовле"ния препаратов при обследоварни 100человек в 3 раза. Формула изобретения