Вптб

00001 ОП ИСАНИ ЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистицеских Республик/Кл. А 611 с 19,О С 07 д 7/О от патента 3,11,1969 ( 1309423/3 7544/6 Велик 5,11,1968,57373/68,и ОЗ.Х 11.1968,ритания иорите Гооударстееивый комитет Совета Министров СССР по делам изобретевнй и открытий(088,8) ь ата опубликования описания 5.1 у.197 Авторыиэобретени Иностранцыил Аке Екштрем, Берндтлин и Ларс Селве Натх(Швеция) Пер Стаффан Делин, Б Сьеберг, Карл Хьюго лоф Хара т-Вестфел Иностранная фирма Актиеболагет Астрааявител ПОАЛЛЕРГЕННОГО ПЕНИЦИЛЛИН ОСОБ ПОЛУЧЕН стракт 300 кг, соевое масло 13,8 кг, парафин1,22 кг, цвтанол О,З кг, фенилуксуоная кислота 2,1 кг, хлористый натрий 112 кг, вода14000 л, рН 6,6,Через 24 час после инкубации при 25 С сперехгешиванием и,продуванием воздуха, когда рН увеличивается до 8,2, бактериальныеклетки убивают путем добавления бутилацетата (180 л) и смесь после этого охлажда 1 от,10 П р и м е р 2, Выделение и очистка ацилазы,Отделение питательной среды и продавливанне клеточного вещества проводят одновременно в самоочищающемся центробежном се 1 б параторе, работающем при 0 - 50 С, в котором отделенное клеточное вещество продавливается в пульсируюгцем цикле за время0,05 - 1,0 сек через мембрану со щелью шириной 0,1 - 1,5 лл под давлением 500 - 2000фунт/дюйме)Пасту бактериальных клеток собирают впорции по 100 кг, к каждой из которых приоавляют 3,0% метилизобутилкетони смесьгомогенизируют с помощью мешалки в тече 2 б ние 25 лин. Оощий выход бактериальной мас.,сы 325 кг.Полученную пастуиспользуют в экспери ктер оактериальных клетокментах по изучению сокидкоредой, ый экИзооретвние относится к области медици ны, точнее к производству антибиотиков.Известен способ получения гипоаллергенного пенициллина, заключающийся в том, что бензилпенициллин,подвергают гидролизу ферментом, выделенным из Е. Со 11, абразовавшуюся 6-аминопвнициллановую кислоту освобождагот от белков-аллвргвнов путем диализа или гельфильтрации,и превращают в целевой продукт, известным лутехг.Цель изобретения - упрощение процесса, Это достигается тем, что гидролиз осуществляют гипоаллергенным ферментом, выделенным из клеток, разрушенных продавливааоием через мембрану шириной 0,1 - 1,5 лл в течение 0,05 - 10 сек под давлением 34 136 атл.П ри м е р 1. Получение клеток ба валькой культуры.,Питательную среду, имеющую следующий состав; кукурузный экстракт 3 кг, соевое масло 135 лл, парафин - парафин 12 л.г, цета.нол 3 лгл, вода 150 л, рН - 6,0, стерилизуют при 124 С в течение 30 лин, засевают 100 л,г 20 - 24 час культуры Е. Со 11 (Аэ 1 га 1339) и инкубируют при 25 С с продуванием и перемешивангием в течение 18 час.Затем полученной культуральнойстью засевают ферментер с посевной с имеющей следующий состав: кукурузнлюбилизации энзима (и 100 г,клеточной пасты дооавляют 100 мл деионизированной воды).Полученную суспензию обрабатывают, налример, следующим образом.Суспензию гомогенизируют с помощью мешалки в течение 5 мин, образец охлаждают в бане со льдом, чтобы температура образца не поднималась выше 35 С. Затем образец центрифугируют при 5000 6 (центробежная сила, выраженная через ускоренне оилы тяжести) в течение 20 мин и определяют активность энзима в поверхностном слое.Гомогенизированную бактериальную пасту (175 кг, активность 190 ед/г) разбавляют водой (175 кг) и при перемешивании смеси додобавляют Нуйо (22,7 кг), Сейе 505 (22,7 кг), ГЬгаПо (10,2 кг). Водную фазу отделяют путем фильтрования через фильтр .цпса и остаток на фильтре,промывают водой (50 л).Соединенные растворы (290 кг),имеют активность 48 ед/г.Гомогенизированную бактериальную пасту (1 кг, активность 212 ед/г),разбавляют водой (2,0 л), устанавливают рН 8,5 путем добавле. ния 0,5 Й раствор МаОН (220 мл) и затем перемешивают при 20 С в течение 30 мин, Смесь центрифугируют при 13200 6 в течение 30 мин при 0 С, Далее декантируют поверхностный слой жидкости, осветляют его фильтрованием н получают 2,7 кг раствора с активностью 50 ед/г. Повторное суспензирование осадка от центри(фугирования в воде (1 л) дважды в течение 5 мин при рН 8,5.с,последующим центрифугированием, давало дополнительное количество раствора энзима (2 кг, активность 11 ед/г). Это соответствует оощему выходу водорастворимой ацилазы, равному 74%.Из полученного прозрачного раствора ацилазы (2 кг, активность 50 ед/г) методом лиофильной сушки получают 98,5 г твердой ацилазы с активностью 950 ед/г.Гомогенизированную бактериальную пасту (1 кг, активность 128 ед/г) центрифугируют сири 13200 6 в течение 30 мин при 0 С, Затем декантируют поверхностный слой жидкости (500 г, активность 80 ед/г), осветляют фильтрованием и,используют для энзиматического расщепления пенициллина с получением 6- аминопенициллинсвой кислоты.П р и см е р 3, Получегтие 6-аминопенлциллнновой кислоты.К раствору энзисма (283 г, активность 42ед/г) прибавляют раствор калиевой соли бензилпенициллина (20 г) в воде (317 лсл),Смесь выдерживают в термостате при 37 С, рН поддерживают на уровне 7,8 перно.дически добавляя 2,5 К раствор ХаОН, Черсз б час реакционную смесь, содержащую 10,7 г 6-аминопенициллнновой кислоты (92% ),фильтруют.Раствор подкисляют до рН 3 5 М соляной кислотой и экстрагируют,половинным объемом метилизобутилкетона для удаления остатков бензилпенициллина и фенилуксуспои 5 10 15 20 25 зо 35 40 45 50 00 кислоты, которая входит в молекулу в видебокового ответвления и отщепляется в процессе образования б-аминопенициллиновойкислоты, После зкстраги(рования водный раствор отделяют от метилизобутилкетана, рНводного раствора устанавливают равным 7,5,упаривают в вакууме до объема 120 мл, охлаждают до 5 С и фильтруют. При подкислении фильтрованого раствора 51 М солянойкислотой до рН 4,3 осаждают кристаллическую б-аминопенициллиновую,кислоту.После отфильтровывания кристаллы сярмывают слегка охлажденной водой, затемацетоном и высушивают в вахууме с,получеснпем 8,84 г 6-аминопенициллияовой кислоты.П р,и м е р 4. Получение паранитробензилового эфира 6-асминоспенициллиновой кислоты.Раствор энзима (18,6 г, активность 1610ед/г) разбавляют водой (700 мл),и метанолом(120 мл), устанавливают рН 7,8, добавляя0,1 Х раствор ХаОН,и прибавляют раствор ннитробензилбензилпенициллината (3,1 г, 6,6моль) в метаноле (60 мл).Смесь перемешивают при 37 С и поддерживают рН 7,8, добавляя 0,1 К распвор МаОН.Через 2,5 час смесь охлаждают и экстрагируют этилацетатом (500 мл). Кислый слойотделяют и экстрагируют дополнительной порцией этилацетата (250 мл), органическиеслои соединяют вместе и высушивают оезводным сульфатом натрия в течение 1 час. Послефильтрования органический раствор разделяют на 2 равные части. Одну часть упаривают в ва;кууме при комнатной температуре,и получают свободный а-нитробензиловыйэфир 6-аминопенициллиновой кислоты в видемаслоподобного осадка. К другой части раствора в этилацетате прибавляют бензолсульфоновую кислоту (0,58 г), растворенную вацетоне (20 мл) и упаривают,полученнуюсмесь в вакууме,до объема 30 лсл.После добавления серного эфира (10 мл 1и выдерживания смеси в течение почи на льдуосаждается бензолсульфоново-кислая сольсс-нитробензил - 6-амичсопенициллината (0,8 г)в виде белыьх кристаллов с т. пл, 148 - 151 С.П р,и м е р 5. Энзиматический синтез бензилпенициллина,6-амипопенчгцнллиповую кислоту (175 лсг)и фенялуксуснло кислоту (111 лсг) растворяют в буферном растворе фосфата калия(О лсл при рН 7,0) и к полученному растворудобавляют растворенную в воде ацилазу.Устанавливасот рН па уровне 5,0 с помощью1 М раствора НзРО 4 и выдерживают в термостате при 37 С. Через 4 час раствор охлаждают и анализируют методом бумажной хрои атогра фси. 30% 6-аминопенициллиновоЙ кислоты превращаются в бепзилпенициллин,Предмет изобретенияСпособ,получе(и я гипоаллергенного пешсщнллпна путем ферментативного гидролиза бензилпенициллина ферментом нз клеток404195 Составитсл: С, 1 Цснсва Текрсд Е. Борисова 1 зсдактор Д, Пинчук Корректор О, Тгорина Заказ 211 Изд.201 Тиран. 462 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытийТии. Харак Аи;,т, иос - с 1 Татспт Е. Со 11 до 6-аминопенициллановой кислоты с последующим ее превращением в целевой продукт известным путем, отличающийся тем, что, с целью упрощения .процесса, гидролиз осуществляют гипоаллергенным ферментом,выделенным из клетокразрушенных продавливанием через мембрану со щелью шириной 0,1 - 1,5 ил в течение 0,05 - 1,0 сек под давлением 34 - 136 атм.5