Способ диагностики клещевого энцефалита

Изобретение относится к медицине,а именно к иммунологической диагностике клещевого энцефалита,Целью изобретения является ускорение и повышение точности способадиагностики клещевого энцефалита.Способ осуществляют следующимобразом.Кровь больного забирают из вены в 10количестве 3 мл в раствор гепаринафз расчета 25 ЕД на 1 мл крови. Выфеление лимфоидных клеток производятотстаиванием в течение 45 мин, Клетки 2 раза отмывают средой 199, центфифугируя по 5 мин при 500 ц, и доводят их концентрацию средой до210 кл/мл, Для приготовления тестЭритроцитарной системы используютстандартный иммуноглобулиновый эритоцитарный диагностикум к вирусу клеЩевого энцефалита, разработанныйУ.Г. Пархоменко и полученный по ори-финальной метопике из свежих бараньих .эритроцитов. Бараньи эритроциты формалинизируют 3 -ным нейтральным формалином при 37 С и в 0,5 ной концентрации смешивают с противоэнцефалитным лошадиным гамма-глобулином производства Томского НИИВС и 30бидиазотированным бензидином (комМерческий препарат).Конъюгацию проводят 45 мин на ледяной бане. Сенсибилизированные эритроциты отмываютзабуференным физиологическим раствором с РН 7,4 и подвергают лиофильному высушиванию в ампулах, Препаратможет храниться длительное время,Перед постановкой реакции сухой эритроцитарной диагностикум растворяют 40в физиологическом забуференном раст.воре с РН 7,4 и обрабатывают в течеоние 1 ч при +4 С коммерческим антигеном вируса клещевого энцефалита. Отмывают 2 раза ЗФР с 1 Н 7,4 путем 45центрифугирования по 5 мин при 800 и.Из осадка готовят 0,5%-ную взвесьэритроцитов на этом же растворе,Постановка реакции. 0,5 мл 05 взвеси эритроцитов, приготовленныхподобным образом, соединяют с равнымобъемом взвеси лимфоцитов, выделенных от больного. Смесь инкубируют3-5 мин при 18-25 С, центрифугируют5 мин при 200 и и выдерживают 20 минпри +4-5 С. Из осадка готовят мазок,офиксируют и окрашивают ио методуРомановского-Гимза. В мазке подсчитывают количество лимфоцитов, образующих ".розетки" с эритроцитами, несущими антиген. За положительный результат принимают величину выше 4%розеткообразукщих клеток,П р и м е р 1. Больной Л. С.И.,40 лет. Заболел 1.7.84 г., госпитализирован в гор, инфекционную больни.цу 2.7.84 г с подозрением на заболевание клещевым энцефалитом. 2.7.84 гиз вены больного забрали 3 мл кровив раствор гепарина. После отстаивания в течение 45 мин при 37 С и отмывания выделено 2 10 клеток в 1 мл.0,5 мл взвеси клеток соединяли с0,5 мл 0,5 .-ной взвеси эритроцитарного диагностикума, инкубировали3 мин при 18 С, центрифугировали ивыдержали , 20 мин при +4 С, затемоиз смеси приготовлен мазок и при подсчете обнаружено 8 розеткообразующих клеток - показатель, свидетельствующий о наличии специфической сенсибилизации лимфоидных клетокорганизма. В официально рекомендованной серологической реакции (РТГА)положительный результат, титр антител 1:80 получен 26,7.84 г - на 26день болезни в третьей пробе крови.Клинический диагноз заболевания -клещевой энцефалит, менингеальная форма, тяжелое течение.П р и м е р 2. Больной Е.В 23года. Заболел 20.7.84 г, госпитализирован 22.7.84 г, при подозрении назаболевание клещевым энцефалитом.Кровь для исследования взята 22.7.84 гв объеме 3 мл. После отстаивания иотмывания выделено 2 10 клеток в1 мл. 0,5 мл взвеси клеток соединялис 0,5 мл 0,5 .-ной взвеси эритроцитарного диагностикума, инкубировалио"5 мин при 25 С, центрифугировали и выдерживали 25 мин при +5 С. После этого из смеси готовили мазок и определили 9 . розеткообразующих клетокк вирусу клещевого энцефалита. Результат РТГА - отрицательный. Клинический диагноз - очаговая форма клещевого энцефалита, средней тяжести -удалось подтвердить при помощи определения розеткообразования при поступлении больного.П р и м е р 3. Больная Л. А.Г.,49 лет. Заболела 17.7.84 г, Госпитализирована 21,7.84 г. Кровь в объеме 3 мл взята для исследования21,7.84 г, После отстаивания и отьывания 05 мл взвеси клеток соединя58,4Положительный эффект способа подтверждается следующими данными: припомощи официально принятых серологических тестов, в частности РТГА иметода антигенспецифического розеткообразования, обследовано 159 больныхклещевым энцефалитом. Диагноз поставлен по клинико-эпидемиологическимданным. Диагностически значимое нарас"такие титра антител в РТГА выявленотолько в 29,93% случаев. Положительные результаты при определении специфического розеткообразования зарегистрированы у 64,96 . больных, чтопозволило выявить специфическую сенсибилизацию к вирусу клещевого энцефалита дополнительно у 35,03 больных. Кроме того, при использованииреакции антигенспецифического розеткообразования лабораторное подтверждение диагноза клещевого энцефалитаускоряется на 10-14 дней по сравнению с использованием традиционныхсерологических тестов (РТГА) и на2 сут. по сравнению с реакцией торможения миграции лимфаидных клетокпо технике исполнения.Формула из о бр етенияСпособ диагностики клещевого энцефалита путем выявления сенсибилизации лимфоцитов к антигену вирусаклещевого энцефалита, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа,сенсибилизацию лимфоцитов выявляютв реакции розеткообразования, приэтом лимфоциты инкубируют с эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом, обработанным антигеном вируса клещевого энцефалита в течение3-5 мин при +18-25 С и не менее20 мин при +4-5 С, и при наличии розеткообразующих клеток более 4%диагносцируют клещевой энцефалит. 1 3960 ли с 0,5 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума, инкубировали 5 мин при 25 С, центрифугировали и выдерживали 15 мин при +5 С. Из смеси клеток готовили мазок, окраши 5 вали и микроскопировали, Определено Зрозеткообразующих клеток к вирусу клещевого энцефалита, отрицательный результат. Диагностически достовер ное нарастание титра антител 1:320 обнаружено во второй пробе крови в РТГА 27.7,84 г. Клинический диагноз заболевания - клещевой энцефалит мей нингеальная форма, средней тяжести. 1.5Таким образом, уменьшение времени холодовой инкубации снижало эффективность розеткообразования. При увеличении времени холодовой инкуба-. ции количество розеткообразующих 20 клеток увеличилось до 7 - положительный результат. Сделан вывод о необходимости инкубации при +4-5 С не менее 20 минП р и м е р 4. Больная Л., 19 25 лет. Заболела 16,7.84 г. Госпитализировали 19.7,84 г, Кровь в объеме 3 мл взята для исследования 19.7.84 г. Выделение клеток производили путем отстаивания в течение 45 мин и после дующего отмывания. Затем 0,5 мл взвеси клеток лимфоидного ряда в концентрации 2 .10 в 1 мл соединяли с 0,5 мл 0,5 -ной взвеси, инкубировалио3 мин при 18 С, центрифугировали, выдерживали 20 мин при +5 С. Из смеси клеток готовили мазок, окрашивали по методу Романовского-Гимза. В результате подсчета под микроскопом определено 4% розеткообразующих кле ток к вирусу клещевого энцефалита. Результаты РТГА отрицательные. Первичный диагноз клещевого энцефалита снят. Окончательный диагноз - реснира". торно-синцитиальная инфекция. 45