Способ определения вирусных антигенов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 60 119) 11 И 33/49 51 4 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН 25150/28 М АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ(57) Изобретение относится к вирусо. логии, Цель изобретения - повьппение точности способа, Получают антиглобулиновую сыворотку против вирусов гриппа и смешивают с сывороткой боль ного . Смесь выдерживают при 37 С 1 ч и центрифугируют. Надосадочную жидкость раститровывают в вирусологи ческом планшете и определяют титр вируса гриппа или его антигенов путем постановки реакции агглютинации куриных эритроцитов. Чувствительность способа повышается в 12 раэ.396059 Путь введения Срок введе- Количество вводимогония (в днях) препарата 0,5 мл полного адъюванта фрейнда + -1- 0,5 мл сыворотки О, мл глобулинов О, мл глобулинов 0,1 мл глобулинов 0,1 мл глобулинов 0,1 мл глобулинов в/к в/м в/в в/в в/м в/в 15 16 17 22 23 Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и можетбыть использовано для выявления циркуляции иммунных комплексов в биологических жидкостях при вирусных инфекционных болезнях, для диагностики и определения активности инфекционного процесса при вирусном гепа.тите. 10Целью изобретения является повышение точности способа эа. счет увелиения чувствительности и специфичйости и сокращение сроков анализа,Цель достигается тем, что сыворотку крови или другой бносубстрат инфекционного больного инкубируют со специфической антиглобулиновой сыворотКой против искомого вируса или вирусйого антигена и с помощью известных 20йммунологических реакций - гемагглютинации, пассивной гемагглютинации,торможения гемагглютинации, преципитации в геле, встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), иммуноферментного или 25Других методов определяют вирус иливирусный антиген,Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1. Для осуществления 30Способа вначале получали иммунную ан-.1 иглобулиновую сыворотку к антителам,иаправленным против искомого вируса -Вируса гриппа или его антигенов.Для этого берут 100 мл сывороткикорови переболевших гриппом больныхсодержащую высокие титры противогриппозных антител (1:320). Затем из,сыворотки методом сульфат-риваноловоговысаливания выделяют глобулиновуюфракцию. К сыворотке добавляют 0,01р-р БаОН, доводят рН до 7,4. Эту сыворотку по каплям со скоростью 4-8капель в минуту вносят в 500 млО,ЗХ-ный раствор риванола при постоянном помешивании. Соотношение объемов сыворотки и риванола в мл должно составлять 15. Смесь в течение 1 чперемешивают и выдерживают в холодильнике при 4 С в течение 12"16 ч. Выпавший осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют активированный уголь (3-4 гр) до полного обесцвечивания пены. Смесь перемешиваютЗО мин и фильтруют. К полученномуфильтрату сыворотки при постоянном перемешивании прибавляют со скоростью10 капель в минуту насыщенный раствор (ИН)804. до 457 насыщения, перемешивают в течение 1 ч и охлаждаютпри 4 С в течение 16 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в дистиллированной воде, раствор диализуют через целлулоидную пленку с диаметром пор 320-720 ммк против 0,15 М раствора ИаС 1В процесседиализа объем высоленных глобулиновдоводят до 1/10 ч. по отношению кобъему исходной сыворотки, т,е. до10 мл.Полученный препарат - иммуноглобулин против вируса гриппа - характери"зуют по следующим параметрам:1. Активность противогриппозныхантител, Титр в реакции торможениягемагглютинации составляет не менее1:2560.2. Количество белка, Препарат содержит не менее 8 мг белка в мл, чтосоставляет 507 по отношению к исходному его количеству в сыворотке крови,3. Содержание альбуминов. Препаратсодержит 0,3 мг/мл альбумина, что непревышает 3,87 по отношению к общемуколичеству белка в препарате,Специфическую антиглобулиновую;сыворотку против иммуных противогриппозных глобулинов получают путем им"муниэации кроликов высоленным препаратом по следующей схеме:з139605924 0,1 мл глобулинов в/в29 0,1 мл глобулинов в/м30 0,1 мл глобулинов в/в31 Оф мл глобулинов в/вП р и м е ч а н и е: в/к - внутрикожно; в/м -внутримышечно; в/в - внутривенно,Через 7 дней после последнего оро- предлагаемого способа в 10,25 разка введения препарата проводят забор выше известного,крови, из которой получают сыворотку. О . П р и м е р 3. Определение специПолученная антисыворотка содержит ан- фичности способа.титела против человеческих иммуногло- В сыворотках 156 больных с диагнобулинов к вирусам гриппа, т.е. анти- зом аденовирусная инфекция, паратела против спЕцифических противо- , грипп микоплазменная инфекция, орвищУгриппозных антител. Титр полученной определяли содержание антигенов вирусыворотки 1:128. са гриппа известным способом. И в сыДля определения вирусных антиге- воротках 168 больных с теми же диагнов берут две пробирки с О, 25(0,05)мл нозами - предлагаемым способом. Спеисследуемого биосубстрата (сыворотка цифичность определяли соотношениембольного) и в 1 из пробирок вносят количества отрицательных результатов200,25 (1;1,05) мл полученной кроличьей в контрольной группе к количествуантиглобулиновой сыворотки в рабочем обследуемых лиц в этой группе, умножен"титре 1:16. В другую пробирку вносят ,ное на 100 Х, Известный способ обес 0 25 (О 05) мл 0 15 М раствора ИаС 1, печил 21 отрицательную находку вирусзаб фе енно о 0 01 М фосфатным буфе ного антигена, что составляет 3,5725 13ром р Н 7 0-7 1 (контроль). Пробирки специфичн в то времЯ как предвыдерживают 6 мин при60 и 37 СС затем лагаемый - 163, что составило 91 9центрифугируют мин приф 20 и 3000 об/мин специфичности. Таким образом, специпифичность предлагаемого способа приНадосадочную жидкость отбирают пипет"кой и раститровывают в вирусологичесв ирусологичес 30 определении антигенов вируса 1 риппаком планшете, ячейки которого заполв 6,7 раза вьпне известного,П р и м е р 4. Сыворотку крови реренного конвалесцента М. исследовали на наличие вируса гриппа, находящегося в7,0-7,1. В этом планшете определяюттитр вируса гриппа или его антигеновн и35 иммунном комплексе вирус гриппа + анпутем постановки реакции агглютинатитело. Известным способом вирус грип"па из сыворотки крови не выявлялся.ции куриных эритроцитов. Так, в контЕго удалось выделить лишь после оброльном материале титр вирусных анработки этой сыворотки антиглобулитигенов составляет 1:2, а в опытномобразце, обработанном антиглобулиноан иглоб л н 40 новой сывоРоткой, полученной как оливой сывороткой, 1;8-1:16, Таким об- сано в примере . Для этого сыворота ае ый пособ повышает ку кРови инкубировали с антиглобуликак минимум, вли его антиге мин, после чего этим материалом заления вирусов гриппа или его антиге 45 ражали 9-10-дневных куриных эмбрионовнов.введением материала в объеме 0,2 млП р и м е р 2. Определение чувст- в аллантоисную полость. Зараженныевительности способа, эмбрионы инкубировали в течение 72 чСыворотки 510 больных гриппом ис- при 330 С, после чего их охлаждали,следовали на наличие антигенов виру аллантоисную жидкость отделяли и исса гриппа известным способом и сыво- следовали на наличие вируса гриппа вротки 712 больных - предлагаемым спо- реакции агглютинации куриных эритрособом. Сроки определения вирусных цитов. Титр вируса в аллаитоисноиантигенов и возраст . больных обеих жидкости составляет 1:16. Таким обгрупп обследуемых были идентичными. 55 разом показано, что в исследуемой сьгИзвестный способ позволяет выявить воротке больного находился вирус грипантиген лишь в четырех случаях, в па в форме иммунного комплекса.то время как предлагаемый - в 41 слу- Исследованы биосубстраты 356 больчае, Таким образом, чувствительность ных гриппом. Вирус гриппа, находящий 1396059ся в форме иммунного комплекса, обнаружен в 5,8% случаев.П р и м е р 5. Способ опреде.пения антигенов вируса гепатита В.5При осуществлении способа получают иммунную антиглобулиновую сыворотку против антител, направленных против НВэАК. Для этого из сыворотки крови больных, переболевших вирусным гепати 10 том В с высоким титром антител против вируса гепатита В (1:128), методом сульфат-риванолового высаливания выделяют гамма-глобулиновую фракцию, как в примере 1. Полученным гамма-гло 15 булином иммунизируют кролика по схеме, описанной в:примере 1. Через 7 дней после последнего введения препарата проводят забор крови, из которой получают сыворотку. Полученная кроличья сыворотка содержит антитела против человеческих иммуноглобулинов к антигенам вируса гепатита В, т.е. антитела против специфических антител к НВАя. Титр полученной сыворотки 1; 128.С помощью полученной сыворотки по предлагаемому способу определяли антиген вируса гепатита В т.е, НВэАд. Для этого анализировали сыворотку крови контактного по гепатиту В, у которого клинические симптомы болезни не были зарегистрированы. Уровень антител к НВ Ая в этой сыворотке составлял 1:2. После испольэования предЛагаемого метода с добавлением к исследуемому материалу антиглобулиновой сыворотки титр НВ Ад составил 1:256.П р и м е р 6, Определение чувствительности способа определения ан 40 тигена вируса гепатита В.Сыворотку, полученную от 196 больных вирусным гепатитом, исследовали на наличие НВАа; известным способом, а от 21 больных - предлагаемым спо 45 собом. Известный способ позволил выявить в 15 случае НВАя, что состави" ло 79,2%, в то время как предлагаемый - 160 положительных реакций или 84,6%.Таким образом, чувствительность предлагаемого способа в 1, 2 раза превьппает известный способ.П р и м е р 7, Определение специфичности способа определения антигена вируса гепатита В.55В сыворотках 121 больного с диагнозом "гепатит А" "колиэнтериты" определяли содержание НВэАд известным и предлагаемым способом, Оценкуспецифичности способа давали по методу, описанному в примере 3, Известныйспособ обеспечил 57 отрицательных находок, что составляет 47,1% специфичности, в то время как предлагаемый -119, что составило 91% специфичности.Таким образом, специфичность предлагаемого способа при определенииЕВ Лд в 2 раза выше известного.П р и м е р 8. Сыворотку крови реконвалесцента Г. исследовали на наличие НВ АК, находящегося в форме иммунного комплекса НВ Ац + антитело,Известным методом исследования выявить, НВз А находящийся в форме им-мунного комплекса не удалось. Он определен лишь после обработки этой сыворотки антиглобулиновой сывороткой.Для этого сыворотку крови инкубировали с антиглобулиновой сывороткой при3 С в течение 60 мин, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мини определяли НВзАд. Титр НВ Ад составил 1:16. Таким образом показано,что в исследуемой сыворотке находилсяНВАд в форме иммунного комплекса.Предлагаемым способом исследованысыворотки крови 211 человек; 83 больных острым гепатитом В, 9 - затяжным,27 - хроническим активным, 14 - хроническим персистирующим, 59 "здоровых"доноров носителей НВ Лд, Предлагаемыйспособ позволяет выявить НВ Ая на 3,433% случаев чаще, чем известный, ау оессимптонных носителей - на 78,5%.Таким образом, предлагаемый способповышает точность определения вирусных антигенов за счет увеличения чувствительности и специфичности анализа при определении антигенов вирусагриппа и гепатита В, а также даетвоэможность определить вирусы или пхантигены, входящие в состав иммунныхкомплексов, в течение 4 ч, в то время как по известному способу на этиисследования необходимо 48 ч,Формула изобретенияСпособ определения вирусных анти- генов путем исследования сыворотки крови, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет увеличения чувствительности и специфичности и сокращения продолжительности анализа, исследуемую сыворотку для образования иммунных комплексов обрабатывают равным объе.1 396059 8мом антисыворотки, полученной иммуни" нием комплексов центрифугированием изацией кроликов антителами человека определением содержания антигена впротив вируса, с последующим отделе- надосадочной жидкости,Составитель Л.ПадюковРедактор М.Бандура Техред М.Ходанич Корректор И,ДемчикЗаказ 2490/46 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4