Способ определения ангиотензина 11

(19) (1) СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 7 А 1 М 33/48, 33/535 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ЕТЕЛЬСТ К АВТОРСКОМУ ЕНЗИедипредзинац тносится к(57) Изобретеницине, а именно к иммунохимии,нализа ангиотенких жидкостях.овышение чувств назначено для.11. в биологиизобретения итель ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ(71) Всесоюзный кардиологическийнаучный центр АМН СССР) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИ ности и упрощение способа. Для этого проводят синтез конъюгата ангиотензина 11 с кроличьим сывороточным аль. бумином. По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 М ЯаС 1. Также проводят синтез конъюгата ангио тензина 11 с гемоцианином, смешанным с полным адъювантом Фрейнда 1:1. Иммунизацию проводят подкожно, в/мышечно. Первые 3 инъекции кроликам вводят конъюгат антиотензина П с кроличьим сывороточным альбумином, последние 2 - конъюгат 11 с гемоцианином. Между инъекциями 2-х недельные перерывы. Отбор крови у кроликов через 7 дней после последней инъекции. Затем проводят синтез антиотенэина 1 Е, меченого пероксидазой из хрена, выявление ангиотенэина 11 ведут по активности пероксидазы в иммунном комплексе.25 Изобретение относится к медицине,а именно к иммунохимии, и может бытьиспользовано при анализе ангиотензина 11 в биологических жидкостях.5Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощениеспособа.На чертеже показана калибровочная кривая определения ангиотензииа 11.П р и и е р. А. Синтез конъюгата ангиотензина 11 с кроличьим сывороточным альбумином.4 мг ангиотензина 11 и 22,2 мг 15кроличьего сывороточного альбуминарастворяют в 200 мкп воды, Затемприливают 200 мкл раствора 1-этил 3(3-диэтиламинопропил)карбодиимида(0,4 мг/мл) и проводят реакцию при 20комнатной температуре и течение30 мин при постоянном перемешивании.По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 М:ЯаС 1,Б. Синтез конъюгата ангиотенэиыаП с гемоцианином.2,15мг ангиотензина 11 и 15,6 мггемоцианина растворяют н 250 мкл воды. Затем приливают 250 мкл раствора1-этил(3-диэтиламинонропил)карбодиимида (0,47 мг/мл) и проводят реакцию при комнатной температуре н течение 30 мин при постоянном перемешивании. По окончании реакции конъюгатдиализуют против 0,15 ИаС 1.35В. Схема иммунизации.В качестве антигена используютконъюгат ангиотензина 11 с кроличьимсынороточным альбумином и конъюгатангиотензина 11 с гемоцианином, смешанным с полым адъювантом Фрейнда1:1 (об./об.), Иммунизацию проводятподкожно, внутримышечно в пятки задних лап кроликов (0,3 мл смеси накролика). В первые три инъекции кроликам вводят конъюгат ангиотензина11 с кроличьим сынороточным альбумином, в последние две - конъюгат аь; -гиотензина 11 с гемоцнанином. Междуинъекциями двухнедельные перерывы, 50Отбор крови у кроликов осуществляютчерез 7 дней после последней инъекцииГ. Синтез ангиотензина 11, меченного пероксидазой. 55К 1,8 мг пероксидазы из хрена(К=3,О), растворенной в 0,5 млдистиллированной воды, приливают 100 мкл водного раствора Ба 10 о с концентрацией 21,4 мг/мл. Окисление пероксидазы проводят при комнатной температуре в течение 20 мин при постоянном перемешивании. Полученный раствор диализуют против 1 мМ ацетатного буфера рН 4,7 в течение ночи при 4 С.К окисленной пероксидаэе добавляют 2 мг ангиотензина 11, растворенного в 510 мкл 14 мМ карбонатного буфера, рН 9,6. Реакцию ковалентного связынания пептида с ферментом проводят при комнатной температуре в течение 5 ч при постоянном перемешивании.По окончании реакции в реакционную смесь при 4 С добавляют 50 мкл раствора ИаВН с концентрацией4 иг/мл. По прошествии 2-х ч восстановленный конъюгат помещают на диализ против 1,5 л 0,01 М фосфатного буфера,рН 7,4 при 4 С в течение 20-24 ч,Полученный конъюгат ангиотензинаП с пероксидазой хранят н 50 глице"рина при -20 С,Д. Определение содержания ангио 1тензина П в исследуемом образце.К 100 мкл человеческой сывороткикрови больных и здоровых доноров впластиковой пробирке приливают400 мкл с 0,05 М фосфатного буфера,рН 7,4, содержащего 0,01 М ЭДТА, 1 .бычий сывороточный альбумин, 20К 1 Б/мл "Гордокса", 100 мкл кроличьей антисыноротки, полученной противангиотензина 11, и 500 мкл конъюгата ангиотензина 11 с пероксидазой и инкубируют при 4 С в течение 16-20 ч,В результате серологической реакции образуется иммунный комплекс антиген-антитело, который осаждают добавлением 200 мкл бараньей антисыворотки протин 1 яс кролика в б -номрастворе полиэтиленгликоля н течение 30 мин при 4 С. После отделения осадка от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4 С и отмывки осадка 0,15 М раствором НаС 1, содержащим 0,05 Твина, проводят регистрацию ферментативной активности нерастворимого иммунного комплекса. Для этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл субстратной смеси, содержащей 0,01 . Н О, 1 мг/мл аммонийной соли 2,2-азидо-ди-(3-этилбенэтиазолин)з 13960 сульфокислоты в 0,0 1 М цитратного буфера, рН 4,0. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 90 мин и регистрируют изменение оптической плотности при 414 нм на спектрофотометре СФ.Содержание ангиотензина 11 в ис-. следуемой сыворотке определяют иэ калибровочной кривой.Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве ис-следуемого образца берут пробу с известным содержанием ангиотензина 11 и 100 мкл сыворотки, отдиализованной против О,ООЗМ раствора ЭДТА, содержащего 0,15 М НаС 1, в течение 48 ч при 4 С.Полученные данные свидетельствуют о том, что предел детекции предлагае мого способа значительно выше, чем у известного способа, что позволяет ф 4/4 45 О,Б 12 ГХ Х Ю ЯСоставитель И. ВашкаевМ. Бандура Техред М,Ходанич Корре к.Максимишнне Заказ 2490/ Подписноекомитета СССРоткрытийкая наб , д 4/5 иятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Производственно-пол ческо д 6 Тираж 847 ВНИИПИ Государственног по делам изобретений 13035, Москва, Ж, Раувопределить концентрации ангиотенэина 11 меньше 2 мг/мл. Формула и э о б р е т е н и яСпособ определения ангиотензина 11, включающий конкурентное взаимот действие между исследуемой пробой, меченным тест-антигеном и специфической антисывороткой с последующим отделением иммунного комплекса и вы . явлением ангиотензина 11 по количест ву метки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствителывсти, используют антисыворотКу, полученную путем последовательной иммунизации конъюгатом ангиотенэина 11 с кроличьим сывороточным альбумином и конъюгатом ангиотенэина 11 с гемоцианином, и выявление ангиотензина П ведут по активности пероксидазы в иммунном комплексе.