Способ определения холестерина в крови

)4 601 И 3 ТИИ ЗОБРЕТ ЕНИЯ ПИ,13Я( ЬК 9МУ СВИДЕТЕЛЬСТВ КАВ ой проб ере,сотат,хло 28-1(7 1) Институт биохимии АН ЛитССРи Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и рерментов медицинского назначения(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНАВ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине, точнее к электрохимическим способам анализа концентрации холестеринав крови путем измерения тока ферментных реакций при электролизе. Цельизобретения - упрощение способа засчет исключения стадий. Для этого ктролиэ исследу ронодят1 епьнойдержащем м б рови в росфат этилендиаминт етра ристыи холе етер роло ии, нативну в дезоксзид натрия которого п сидазу, качеств ня и ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ С ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТН холат натрия. Для осуществления способа используют измерительную ячейку, состоящую из корпуса, входного и выходного патрубков для промывки, измерительной камеры, в которую помещены рабочий Рй-электрод, покрытыи 32- слоиной мембраной, и А 8/АцС 1-электрод сравнения с отверстием для введения пробы и фермента. Под действием фермента окисляется холестерин, выделяется перекись водорода. Электрохи- Е мическое ее окисление на РТ-аноде при 0,6 В отн.насыщ, Ар/А 8 С 1-электрода сравнения генерирует анодный ток, величина которого, пропорциональна концентрации холестерина. 4 табл. 2 ил, 13797 ЗЬИзобретение относитс я к медицине,в частности к электрохимицеским способам анализа концентрации холестерина н крови путем измерения тока5ферментных реакций при электролизе.Цель изобрс тения - упрощение спос.оба эа счет исключения стадий,На фиг. 1 изображена схема измерительнои ячейки; на фиг, 2 - калибро Овочный график зависимости тока отконцентрации холестерина.Измерительная ячейка для осуществления способа(фиг.1)состоит иэ корпуса1,изготовленного из органического стек ла и содержащего входной и выходнойпатрубки для промывки и заполненияячейки буферным раствором, и измерительной камеры 2 с магнитнои мешалкой 3, н которую помещены рабочий 20РТ-электрод 4, покрытый трехслойноймембраной 5, и Ад/АРС 1-электрод 6сравнения, и которая содержит верхнее отверстие для введения пробы ифермента. 25Трехслоинля мембрана 5 изготовлена по известной методике с использованием лансановой мембраны проницаемостью 10,77. и диаметром пор 0,54 мкм,полупроницаемои ацетатцеллюлозной 30мембраны, а вместо ферментатинногослоя находится иммобилизованный альбумин. Промывка и заполн ние ячейкибуферным раствором осуществляется припомощи двухканального перистальтичес 35кого насоса. Рабочий и вспомогательный электроды присоединены к полярографу с самописцем,В измерительную ячейку, содержащуюбуферный раствор, вводят 0,02 мл раствора холестерина и через 10 с0,05 мл раствора холестеролоксидазы,Под действием фермента окисляетсяхолестерин и выделяется перекись водорода. Электрохимическое ее окисле 45ние на РЕ-аноде при 0,6 В относительно насыщенного Ар/АцС 1-электрода сравнения генерирует анодный ток, величина которого пропорциональна концентрации холестерина. Платиновый электрод отделен от реакционной смеси трех-слойной защитной мембраной, что обеспечивает отсутствие Фоновых токов ипри введении пробы крови в ячейку.Изменение фонового тока в 50-кратноразбавленной крови не превышает 1-27. 55Поэтому концентрацию холестерина вкрови определяют по калибровочномуграфику для чистого раствора. После анализа ячеика промывается в течение 1,5 мин струей буфера, после чего можно проводить следующее измерение.П р и м е р 1. Определение зависимости величины стационарного тока электрода от концентрации холестеролоксидззы. Электролиз раствора проводят в присутствии 0,2 мМ холестерина в ячейке в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,1 М КС 1, 1 мМ ЭДТА, 0,27. дезоксихолата натрия и 5 мМ азида натрия. Полученные результаты приведены в табл. 1.Данные табл. 1 показывают, что резкая зависимость тока от концентрации ферме н та н а блюд ае тс я до О, 3 3 ед/ мл,П р и м е р 2. Определение зависимости стационарного тока электрода от концентрации холестерина.Проводят электролиз в присутствии 0,33 ед/мл холестеролоксидаэы. Другие условия, как в примере 1. Степень разбавления образцов в ячейке - 50 раз. Результаты приведены в табл.2.Из табл. 2 видно, что в интервале концентраций холестерина 1-10 мМ наблюдается прямолинейная зависимость тока от концентрации. По данным табл, 2 строят калибровочный график, используемый затем при определении холестерина в крови (фиг. 2).П р и м е р 3. Определение зависимости стационарного тока от концентрации азида натрия.3 лектролиэ раствора проводят в присутствии 20 мкл крови, 0,40 ед. холестеролоксидаэы в буферном растворе, содержащем 0,227. дезоксихолата натрия и азид натрия в интервале концентраций 2-14 мМ. Другие условия электролиза, как в примере 1.Результаты приведены в табл. 3.Из данных табл, 3 видно, что приопределении холестерина в крови приувеличении концентрации аэида натриядо 3,0-4,0 мМ ток электрода увеличивается, в интервале концентраций4,0-7,0 не меняется, а в дальнейшемначинает падать. При измерении холетерина в водных растворах в этом интервале концентраций аэида ток практически не меняется. Таким образом,при реализации способа применяется4-7 мМ азида натрия в буферном растноре,0,033 0,066 0,132 0,198 0,264 0,33 0,50 0,060,12 0,23 0,275 0,29 0,30 0,305 Ток электрода, мкА Таблица 2 Концентрация холестерина, мМ 0,02 0,04 0,08 0,1 0,12 0,16 О,30,5 59,2 118,0 148,0 181,0 238,0 292,0 Ток,нА Таблица 3 / Концентрация азиданатрия, мИ 2,0 2,5 3,0 4,0 5,0 7,0 9,0 11,0 14.Г) Ток электрода, нА 40,0 45,0 49,0 51,0 52,0 52,0 48,0 45,0 40,0 Таблица 4 Концентрация деэоксихолата натрия,О,1 0,15 0,18 0,20 0,22 0,30 0,40 0,60 0,80 1,0 15 35 48 50 48 45 40 35 30 25 Ток электрода, нА П р и м е р 4, Определение за - висимости стационарного тока пт концентрации дезоксихолата натрия. Электролиэ раствора проводят,в присутствии 20 мкл крови, 0,50 ед. холестеролоксидаэы в буферном растворе, содержащем 7 мМ азида и 0,1- 1,ОХ дезоксихолата натрия. Другие условия, как в примере 1. Результаты приведены в табл. 4,Данные табл. 4 показывают, что при определении холестерина в крови наибольший ток наблюдается при концентрации деэоксихолата натрия 0,18- 0,22%. Ф о р м у л а и з о б р с т е и и яСпособ определения холестерина в крови, включающий электролиз исследуемой пробы в фосфатном буфере, содержащем этилендиаминтетраацетат, хлористый калийнативную холест ролоксидазу, азид натрия и детергент с последующей регистрацией величины анодпого тока в сравнении с контролем, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа эа счет исключения стадий, электролизу подвергают пробу цельной крови, в качестве детсргента применяют дезс ксихолат натрия в конпентрации 0,18 0,22 мас.7,а холестеролоксидаэ и азии натрия используют в концентгации 0,33 - -0,5 ед./см и 4-7 мМ соответственно,Таблица 11797 18 300 ООЦ 008 011 ОЖ Р,Юмопестерин 3, иМ б яикеРог. Г Составитель А, АгуреевТехред М.Дидык Корректор С. Шекмар Редактор В. Данко Заказ 977/48 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета ГССРпо делам изобретений и открытий1130 З 5, Москва, Ж, Раущская наб д45 Произкод твенно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4