Способ определения оксидазной активности церулоплазмина

/48 С 94 СО ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЛЕНИЯ ОКСИДАЗНПЛАЗ МИНА А. Н. Баха произвадовБасевич,.В. ВоВ. Бере 1981, У ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт биохимии ими Киевское предприятие поству бактерийных препара(56) Лабораторное дело,с. 334-335,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕ ОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕРУЛО(57) Для повышения точности и чувствительности способа к пробе, содержащей церулоплазмин, дЬбавляют раствор о-фенилендиамина. Проводят реакоцию при 37 С, затем добавляют ингиби рующий агент - 963-ную серную кислоту до конечной концентрации 0,3 О, 6 М. Через 5 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм и рассчитывают активность церулоплазмина,1334089 сс 10 15 20 25 П юг 60А10 30 35 40 45 50 Э 49 г 60 (мин)15 (мин) Изобретение относится к биохимиии может быть использовано в биотехнологии для контроля производственных процессов и в медицине для диагностических целей.Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа эасчет использования в качестве субстрата о-фенилендиамина, а в качествеингибирующего агента - серной кислоты,Способ осуществляют следующим образом,К пробе, содержащей церулоплазмин(ЦП), добавляют раствор о-фенилендиамина, предварительно прогретый донужной температуры, инкубируют и останавливают реакцию добавлением 96%ной серной кислоты до конечной концентрации 0,3-0, б М. Через 5 мин.иэ -меряют оптическую плотность при492 нм и рассчитывают активность ЦН.П р и м е р 1. Определение активности ЦП в растворе при контроле технологического процесса его очистки(при 37 С) .В 5 пробирок вносят по 3 мл 2гсс 10 М (210 мг/100 мл буфера) раствора о-фенилендиамина в 0,1 М буферном растворе ацетата натрия (рН 5Растворы прогревают в течение 10 минна водяной бане при 37 С, затем вкаждую из пробирок вносят по 0,05 млисследуемого образца и проводят реакцию в течение 15 мин при 37 С, Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл96%-ной серной кислоты (конечнаяконцентрация 0,3 М) и через 5 минизмеряют оптическую плотность смесина длине волны 492 нм (Ра ); В контрольную пробирку вместо раствора, со.держащего фермент, добавляют 0,05 млбуферного раствора.Так как активность (А) ЦП принятовыражать в единицах изменения оптической плотности эа 1 ч, то зная 1 си время проведения определения (вданном случае 15 мин), ее рассчитывают по формуле 49 г = 0,73 + 0,04 (сРеднее из 5 измерений).А=2,94 + 0,15 опт.ед./ч. При использовании калибровочных графиков можно определить концент рацию ЦП в пробе Для рассчитаннойактивности она равна0,365+0,018 мг/мл.,П р и м е р 2. Определение активности ЦП в сыворотке крови с пониоженным его содержанием (при 60 С),В 5 пробирок вносят по 3 мл2 10 М (210 мг/100 мл буфера) раствора о-фенилендиамина в 0,1 М буферном растворе ацетата натрия (рН 5,5).Растворы прогревают в течение 10 минна водяной бане при 60 С, затем вносят по 0,05 мл исследуемого образцаи проводят реакцию в течение 10 минопри 60 С; Реакцию останавливают добавлением О, 1 мл 96%-ной серной кислоты (конечная концентрация 0,6 М)и через 10 мин измеряют оптическуюплотность смеси на длине волны 492 нм.В контрольную пробирку вместо раствора, содержащего фермент, добавляютО, 1 мл буферного раствора. АктивностьЦП определяют согласно формуле (1): Р 4 = 0,27+0,02 (среднее из 5 измерений), А=1,64+0,13 опт,ед./ч,Аналогично примеру 1 можно определить концентрацию ЦП в пробе - 0,057 + 0,005 мг/мл.Для построения калибровочных графиков используются растворы ЦП с известной концентрацией, которую определяют, измеряя ПО и принимая коэффициент экстинкции равным 1,09 сс 10 М смП р и м е р 3, Способ осуществляют согласна примеру 1, однако реакцию 1 зстанавливают 83 мкл серной кислоты, конечная концентрация 0,5 М, 049 Ь =0,480+0,07 1, оксидазная активность соответственно равна 1,92 + +0,28 отн.ед/ч, При использовании калибровочного графика, при построении которого реакцию также останавливали добавлением 83 мкл 96%-ной Н г 04 К ре ак ЦИОННОЙ сме С И 1 МОЖНО ОП ределить концентрацию ЦП в пробе.Данные по определению активности ЦП в сыворотке крови представлены в таблице. Формула изобретения Способ. определения оксидазной активности церулоплаэмина путем инкуба1334089 Концентрация ЦП в сыворотке здоровых людей, определенная с по" мощью предлагаемого способа,Ч ОтносительнаяопФбка, 3 Концентрация ЦП,мг/100 мл 15,59+0, 70 5,0 19, 48+0, 84 4,3 2,9 3,4 2,3 Составитель Н. ГуляеваРедактор А. Огар Техред И.Попович Корректор Л. Пилипенко Заказ 3959/43 Тираж 776 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 ции образца, содержащего церулоплазмин, с субстратом в присутствии буфера с поеледующей остановкой реакцииингибирующим агентом и спектрофотометрированием, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения точ 17,30+0,50 15,70+0,61 17,69+0,41 ности и чуствительности способа, в качестве субстрата используют оенилендиамин, а в качестве 5ингибирующего агента серную кислоту в конечной концентрации 0,3- - 0,6 М.