Способ определения активности неорганической пирофосфатазы

С 0103 СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 51) С ВЕННЬЙ НОМИТЕТ СС ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ ГОСУД А ПО ДЕЛ НИЯ ВУ ОПИСАНИЕ ИЗО К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена.Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова(56) 1, Патент США 9 3933593,кл, 195-103.5, 1976.2. Бакулева Н.П., Костенко Е.Б.,Байков А,А., и Аваева С.М. Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстратаи его аналогов у неорганической пирофосфатазы.-"Биохимия", 1981, т.46,вып, 5, с.832-838. БО 104954(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕОРГАНИЧЕСКОИ ПИРОФОСФАТАЗЫ, предусматривающий проведение ферментативной реакции с пирофосфатом в присутствии ионов МФги одновременное измерение потенциала катиончувствительного электрода с последующим определением активности по калибровочной кривой в зависимости от величины потенциала или по объему добавляемого пирофосфата при поддержании потенциала электрода на постоянном уровне, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, процесс ведут в присутствии ионов Сц+г, а в качест.- ве электрода используют Сц в .селек- ЕИзобретение относится к биохимп .и аналитической химии, касается определения активности Фермента неорганической пирофосфатазы и можетбыть использовано в медицине ггц робиологической и пищевой отрасляеопромышленности,Известен спектроФотометриесгс)способ определения Ферментати:. НОЙаКТИВНОСТИ В СЛУЧаях згзс 1 И 3 Уг,Рмая реакция сопровождается изменением поглощения света или когда продуКт реакции - субстрат другого Фермента, реакция которогс сопровождаЕТСЯ ИЭМЕНЕНИЕМ ПОГЛОЩЕНИЯ СВЕтагтогда последний фермент добавляот вспектрофотометрическу:о кювету,В настоящее время все больнеераспространениеОлуза)т спос;обг:гопределения активОсти 1)ерОн .ов,Основанные на регистиаццц 31 с)1,ПРОИСХОДЯИХ Пи ПОтоКаЦ; Б .РСДЕ РаЭЛЦЧНЫХ ЭЛЕКТРОХЦ 1 исССКИХпроцессов. Такие ссабы облааютвь ОКОЙ .ТО;остео, це ";)ебуют с.лот.НОГО ОбОРУДОВаНИЯ с. ОПР;ДЕЛЕЦС ЦСзанимает много времсзцц,Известен метод О:ецззееця акти-,ности Ферментов с с гсг:ье) кисло:одНОГО ЭЛЕКтРОДа, За;Л О гаОЩЦЙС с = -. )Г1 ТО В РЕа КЦ" СЗ 1 НгО Я,г -СУб Р ингО КИС) 1 С)1),д;ЬМ Э,СК 1)С;О 1, ГГЕ".щают субстра.с и вс)1 он . и цолц;)о -графине)кСгистр:;р,) Измспс:Н 3ко нцс и трап и 1 к ислО 01 ацгрО 30)де) 1: "льное актецяости с,)."ецтаОднако использс 1)апис: это 0 спОз"ба ОГрз 1 ИсНО оса 10 ц":и геро 1 с)ц а. "НЫМИ РЕа;1-1;МИ, ССГЦ О -Ц К;Е.,.1: С;.ИзМЕЕСЦЦП.". ОЦЦРЦ "Г, ГГС СЛСГ, Г,;ЦацбвГ.0 Л 1 К;г".1 ; 1)сб", г цОтехнгческс Й с)уП.ссти -,: с.я ":ц - соб опрсздс:.лец;я ак г;гп с.:тг,",;л)г:ЦИЧЕСКОЙ ЦЗОООСг)ат:гз 1, . т:.". Г ООВЕдения Фе):ентативцой):аке и с. Пи; -Фосфатом з пс)есутстс ц .о )аЛа Ид"-УСВЦ- РЛ:ОГ ЭТ. - г;-РО ас послеп си эп,Р). с гР 1 гем а" тз 3 цго"ти по калиб)Овогг;Й кр 1 вой в 3 с в 0)МОСТИ ОтЕЛИЧИНЫ ПОТ сдисЗЛс ИЛгПСобъему добавляемого .в .Ирофо Фата рцподдержании потенциала электрспана постоянном уровне.аГЕЕЙг ИОНЫ КОТОРОГО ПРИСУСТОУ"ют в реакционной среде, в данное,СЛУЧаЕ ГОМИМО аКтИВатОРНОЕ УЕКЦгвыполняет также роль индикатора,Сам метод основан на значительномразличии средства индикаторных ионов к субстрату и прсзтукту Ферментативной реакции, По измененц:о концентрации иона-индикатора, измеряяпотенциал соответствующего электрода, судят о скорости реакции, с,-определяют активность Фермента,Определение активности Ферментаможет быть осуществлено с помощь.о сап) ;ССГОЙ КРИВОЙ г ЦаХОДЯ ПО НЕЙзнаЧЗНИЕ сСКОМОЙ,ВЕЛИЧИНЫ НЕПОСРЕДСтнс:- Н.г Э -аЗИСИМОСтц От золЧИЕЫпоо:г;ци: в .з;, оибо измерением объемаги.0;. - :;. Лоб.пяом-."о в се уС гЕ.ЬО ПстЗОРжаИЯ ОТЕЦЕНЛа ГОс:воя цць".гцс,гз,ост 3 тко Извес. НОГО спОсОбаявля- в 11; то чзо оц дает яоспроиэг- ,о;,.И.гцс- ;.:3 г;г . аТЬ,)г;":ЗЬ В ОГОанИ" ".ЕП)г Об 1 с 1 СТП 3 -:а Ч Е ций КОНЕНТ-цийсубстрата и но 0 в сСООтЗРтственно О 05-0,5 и 0,1 Е 1)которыеобеспечивают изменение потенциалавлек рода не менее чем на 5 МБ дляобес;еч)цил сочности измерения 10,Трс)гб)есгое коцггееТрации металла-инЗЕКа "0 сс ЦЕ ЯЗЗЯЮТС Я ОПТима ЧЬНЫМИ ДЛЯс)к г 11;0,:тгг ц)с 1 Гае 3 НОЙ и;РОФРс. З. О-,Спос 0,Га Па ВЕ-аИЕУ ПРЕЗгза.1".") МГэозмо:1 ЕО .И ВЫСОКОЙко ;.с- Ц ";оп;ц;,:е галле.-актгнатОРа, чтопо .Сз.:. т повысить то.еность опреде.1 3" ОГЕ С 11-,С О - г 1 ОТЬ Воз -МО;:цС г ц".,:. ЕН НЕя ЗОСОба,ТЦ Сг:;гг 5 Зог В ГЗИС,-.Е;,1 У ДЛЯ ОПсЕ ВП Я Оц Н.) ФЕС,:,Рг-Т=ТГВцуО ЕактЕО гО.; сЮЩГЕаЗНСЕ СРОДСТВО К-,убстрату п 1.одукту. По кольку с г Гб СУГ С ТЭат г,л г " ЗП аЕТО Ег С+с СИЛЬНЕЕ:С ПСОД,кт . В ХО.Е ЗЕОСанта Т 1 В НОЙрса;с:,це коньеетра:,и)-. Ионов Сзф увелеч)сстс:я)о измен нию концентрацииИОНа Г- .0)КЦО С)ДИТЬ 0 СКОРОСТИ,5 одписно аж город,ул.Проектная,4 лиал ППП "Патент" тивности Фермента. Для этого ре- гистрируюФ кривую изменения потенциала катиончувствительного электрода в ходе ферментативной реакции либо с помощью специального устройства поддерживают постоянную кон 5 центрацию иона Сцф 2, добавляя субстрат. В первом случае аппаратурное оформление проще, но для определения активности нужно использовать калибровочную кривую. Во втором варианте активность фермента измеряется непосредственно, поэтому он является более чувствительным.Кроме того, предлагаемый способ позволяет проводить измерения в не прерывном режиме и не приводит к уничтожению ферментативного матери- . ала. Перспективным, представляется использование метода для непрерывного измерения активности Ферментов, иммобилизованных. на твердых носителях, и ферментов, субстраты которых не имеют хромофорных групп и не могут быть определены спектрофотометрическим методом. Использование метода может обеспечить достижение положительного эффекта в определении содержания Фермента в биологических культурах и разработке. способов получения высокоочищенного фермента.П р и м е р 1. Прибавляют неорганическуюпирофосфатазу к раство.ру, содержащему пирофосфат натрия (1 ммоль),хлористый магний(1,5 ммоль) трисовый буфер (рН 7,2) и сернокислую )едь (10 мкмоль). В ходе Ферментативной реакции происходит гидролиз пироФосфата до фосфата. Так как ионы СЛ дают более прочный комплекс с пирофосфатом по сравнению с фосфатом, их концентрация увеличивается. С по мощью милливольтметра в ходе реакции регистрируют изменение потенциала катиончувствительного электрода (модель Г 3002, Фирма фРадиометер, Дания). Характеристика ка либровочной кривой приведена втабл.1.Таблица 1 Различия в скорбстях измененияиотенциала в двух идентичных опытахпри указанных активностях ферментаВНИИПИ Заказ 8361/2 составляют 5-8%. Минимальная концентрация Фермента, вызывающая изменение потенциала катиончувствительного электрода, составляет 0,09 Е/10 мл.При определении активности неорганической пирофосфатазы в растворе, полученном при ее очистке ионообменной хроматографией, скорость изменения потенциала составляет 1,22 мВ/мин. Следовательно, актив; ность фермента равняется 1,95 Е/10 мл Известный метод 2 ) дает значение 1,7 Е/10 мл при ошибке определения 18.П р и м е р 2. Способ осуществляется согласно примеру 1 с концентрацией сернокислой меди 1 мкмоль, концентрацией фермента 1,25 мкг/10 мл пирофосфата натрия 0,3 ммоль и переменной концентрацией хлористого магния, но изменение потенциала катиончувствительного электрода используют для приведения в действие установки рН-стат, которая автоматически поддерживает потенциал, а следовательно, и концентрацию ионов Си 2, непрерывно прибавляя пирофосФат натрия взамен гидролиэованного. Результаты измерений приведены в табл.2. Различия в активностях в двухидентичных опытах при указанных,концентрациях хлористого магния составляет 3-9,. Минимальная концентрация фермента, вызывающая прибавление субстрата при концентрациихлористого магния 0,6 ммоль, составляет 0,05 мкг/10 мл,Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в повышении точности и воэможности более широкого примененияего для определения ферментативнойактивности по сравнению с известнымспособом, а также в простоте определения,