Криопротектор

1 129820Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано принизкотемпературном консервированиибиологических объектов, в частностиклеток крови, костного мозга и перевиваемых клеточных культур,Целью изобретения является повышение степени защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании. ОЭта цель достигается применением1-монометилового эфира глицерина(ММЭГ) формулыСН - СН - СНи й15ОН ОН ОСНв качестве криопротектора.По международной классификации(1961 г.) данное соединение имеет название З-метокси,2-пропандиол.П р и м е р 1. Тромбоциты выделяют из донорской крови методом дифференцированного центрифугирования.Крио",защитные среды готовят в виде 10%-ныхрастворов глицерина и МИЭГ в плазме. 25К томбоконцентрату, содержащему 210 клеток/мл, добавляют медленнокриозащитные растворы в соотношении1:1, так, что конечная концентрацияглицерина и ММЭГ была 57 30Замораживание осуществляют со скоростью 1.0 град/мин до минус 70 С споследующим погружением в жидкий азот,Деконсервярование проводят путем отогрева на водяной бане при 37 С.Морфофункциональиые.свойства тромбоцитов после размораживания оценивают путем подсчета общего количестваклеток в камере Горяева, а также попоказателям ретрактильной и агрегаци- ф 1онной активности (табл. 1). 3 2ток, чем в случае применения глицерина, при этом их ретрактильная активность на 20% вьппе.П р и м е р 2, Клеточную взвесь, костного мозга разводят в соотношении 1;1 с ММЭГ и глицерином, приготовленными на дистиллированной воде до конечной концентрации криопротекторов 5; 7,5; 15%.Концентрация клеток, определенная в камере Горяева, составляет 2,06 х х 10 кл/мл.После 15-минутной эквилибрации клеточную взвесь разливают по 1,5 мл в полиэтиленовые контейнеры и запаивают.Замораживание осуществляют по двух этапной программе; со скоростью1 град/мин до минус 15 С, выдержка 3 мин при минус 15 С, далее до минус 80 С со скоростью 10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот. После 15. сут хранения при азотной температуре минус 196 С отогрев проводят на водяной бане при 40 С до исчезновения твердой фазы.Жизнеспособность клеток костного мозга определяют по методу Шрека,Результаты представлены в табл.2. В табл, 2 приведены сравнительные данные по криозащитной активности ММЭГ и. глицерина при различной конечной концентрации криопротекторов в расчете на исходную концентрацию клеток 2 10мл. Т а блица 2 Крио- Конечная концентрация криопротек- протектора, 7 тор Т а б л н ц аММЭГ 11400275 16640580 18120+500 Криопротектор Показатели 83% 917 оличест Ретрак о тром- тильна оцитов, актив% ность,Стеень Глице+150 11220+440 14300+470рин257 567 717 агрегации 5 О 5% ММЭГ5% глицерин Из табл. 2 видно, что при использовании в качестве криопротектора ММЭГ жизнеспособных клеток на 20-307 больше, чем в случае применения глицерина,Равноценный криозащитный эффект достигается применением более низких 90+2 18+4 35+3 50+5 51 55 Из табл. 1 видно, что при использовании в качестве криопротектора ММЭГ сохраняется на 40% больше кле3 12982 концентраций предлагаемого криопротектора. Так, 807 жизнеспособных кле-ток костного мозга после замораживания можно получить применением 7,5 Ж- ным раствором ММЭГ. тогда как такой же эффект сохранности достигается применением 152-ного раствора глицерина.Сравнительное исследование криозащитной активности глицерина и ИМЭГ Ю было проведено на перевиваемой культуре клеток почки теленка (ПТ).П р и м е р 3. Сформировавшийся монослой клеток перевиваемой линии почки теленка в хорошем морфологичес ком состоянии снимают со стекла смесью растворов версена и трипсина в соотношении 9:1Клеточную взвесь собирают в один сосуд, измеряют ее объем, берут пробу для подсчета кон центрации клеток в камере Горяева,К суспенэии клеток в соотношении 1:1 при постоянном перемешивании добавляют 20 или 103-иый раствор ММЭГ или 203-ный раствор глицерина пита тельной среде, содержащей: 0,5 Х-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса 453; среда 199 453; сыворотка крупного рогатого скота 10%; канамицина сульфат 100 мкг/мл. Концентра ция клеток составляет 2,1 1 О мл,Затем клеточную суспензию разливат в полиэтиленовые ампулы по 1,5 млюапаивают.35Эквилибрацию клеток с криозащитной средой Осуществляют в течение 1,5 ч при 4 фС. Охлаждение проводят в программном замораживателе: на первом этапе со скоростью 1 град/мин до минус 40 30 С, на втором - 5 град/мин до минус 70 С, после чего ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в жидкий .азот (минус 19 бС).45После 20-дневного хранения осуществляют деконсервацию клеток путем отогрева на водяной бане при 37 фС. Размороженные клетки переносят в культу-ральные флаконы, добавляя питательную 50 среду до посевной концентрации клеток (2,1 10 /мл). Культивированиеосуществляют при 37 С, производя че изнеспособость Криопро- Концентрациятек тор о еток ро- ектор Глицерин 1 О 16,2+1,2 74,0+2,2 75,0+1,4 0 17,6+О 5 18, О+1 ММЭГ 82, О+ ных в табл.З,ей, чем глиает более Из данных, представлен следует, что ММЭГ в меньш церин концентрации оказыв выраженный криозащитный э ношении клеток перевиваем ПТ. ффект в отй культуры По истечении 4 сут культивирования монослой клетками бып выполнен на 1003 поверхности культурального сосуда. Клетки имеют полигональную фос хорошо выраженными границами,теряют способности пассироватьсятечение 3 пассажей они без какихтрудностей снимаются со стекла иресеиваются.Иэ приведенных примеров 1-3 слдует, что предлагаемый криопротеММЭГ обладает более высокой степезащиты, чем глицерин, при этом оннее токсичен,е е ор нью меизобретения -монометилового эфира естве криопротектора. орм Применениемглицерина в кач ОЗ 4рез одни сутки замену среды для удаления криопротектора.Сохранность клеток оценивают методом суправитального окрашивания 0,27-ным раствором трипанового синего, а также по динамике и характеру формирования монослоя.Концентрация клеток культуры ПТ и их жизнеспособность в суспензии, подвергнутой криоконсервации под защитой глицерина и ММЭГ, приведена в табл,З.Т а б л и ц а 3