Способ получения олигосахаридной фракции

.,801289 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН ПАТЕНТУ ЬЙЬл и.; "с. 4 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(72) Ульф Пер Фредрик Линдаль, Гудрун Элизабет Бекстрем и Джон Янгве Леннарт Тунберг (ЯЕ) (53) 547.917.07(088.8)(56) Европейский патент У 0014184, кл, С 08 В 37/10, опублик, 07.01.80.Патент Великобритании У 2002406, кл. С 08 В 37/10, опублик. 1979.Патент Великобритании В 2035349, кл. С 08 В 37/10, опублик. 8.06.80. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОСАХАРИДНОЙ ФРАКЦИИ(57) Изобретение касается производных гепарина, в частности олигосахаридной фракции (1), включающей 4-8 моносахаридных звеньев, где указанный олигосахарид содержит по крайней мере одно 3"О-сульфатированное эве(51)4 С 07 Н 3/06, С 08 В 37/1 О // // А 61 К 31/72 но глюкозамина, которое также является 2-0-сульфатированным и 2"Н-сульфатированным, и где указанные звенья соединены переходным моносахаридным звеном, которое присоединено к восстановленному концу 3-0-сульфатированного звена глюкоэамина, которая как обладающая избирательным проти" вокоагулирующим действием может быть использована в медицине. Для выявления более избирательной противокоагулирующей активности получена олигосахаридная фракция 1, Последнюю получают деполимернзацией гепарина обработкой азотистой кислотой в днометоксиэтане при (-10) С с последующим высаживанием этанолом осадка производных гепарина, после чего его растворяют в 0,05 М растворе хрорида натрия (0,05 М НСУ) при рН 7,4 и полученный раствор разделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке, содержащей антнтромбинсефарозу, Установлено, что фракция .1 имеет преимущества в противокоагулирующем действии в сравнении с гепарином, 1 12Изобретение относится к способуполучения новых производных гепарина, именно олигосахаридной фракциивключающей в себя 4"8 моносахаридныхзвеньев, где указанный олигосахаридсодержит по крайней мере одно 3-0 сульфатированное звено глюкозамина,которое также является 2-0"сульфатированным и 2-Я-сульфатированным,и где указанные звенья соединеныпереходным моносахаридным звеном,которое присоединено к восстановленному концу 3-0-сульфатированногозвена глюкозамина, обладающим избирательным противокоагулирующим дей"ствием,Цель изобретения - получение новой олигосахаридной фракции, обладающей улучшеннымпротивокоагулирующим действием в сравнении с гепарином.П р и м е р 1, Приготовлениефрагментов гепарина посредством деполимериэации азотистой кислотойобычного гепарина,Гепарин (0,5 г), изолированный иэ свиных кишок и растворенный в 150 мловоды, охлаждают до 4 С и пропускают чере колонку, заполненную синтетической ионообменной смолой "Доуэкс 50 У" (Н форма), 200- 400 меш. Затем колонку промывают 100 мл воды и промывную жидкость объединяют с пробой, К пробе добавляют 250 мл диметоксиэтана (а 1 уше), охлажденного до минус 20 С, и 10 мл иэоамилнитрита, после чего смесь,оимеющую минус 10 С оставляют стоять 35 мин. Затем реакцию прекращают добавлением Яа ацетата, После добавления 5,2 л этанола выпавший в осадок углевод (производные гепарина) выделяют центрифугированием. Про дукт растворяют в 500 мл 0,05 М растворе НС; рН 7,4. Этот раствор разделяют на порции по 100 мл и фракционируют посредством аффинной хроматографии на колонке, содержащей 75 мл антитромбинсефароэы (около 5 мг протеина на 1 мп геля). Находящийся в колонке адсорбент отжвают солевым градиентом (500 мп 3 М ЯаСУ - 0,05 М трис-НС 8 в резервуаре), причем основная часть материала или проходит неудержанной через колонку или отмывается из адсорбента при низком значении ионной силы (меньшей, чем 0,4 М ЯаСУ), 893922 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 этот материал не обладает биологической активностью, Активные компоненты (материал в виде очищенного олигосахарида отмывают в виде широкой головной фракции 0,5 М ЯаС 1 и 3 М ЯаС 2, соответствующие примерно37 исходного материала. Эти фракцииобъединяют, концентрируют и обессоливают посредством хроматографии на геле.Олигосахариды, приготовленные и очищенные по указанному способу, имеют преобладающий молекулярный вес приблизительно 1200-2400 дальтон, соответствующий таковому у октасахарида, соответствующего изобретению.Исследование противокоагуляционной активности,Олигосахариды, приготовленные по примеру 1, исследуют, имея в виду их способность: воздействовать на ингибирование энзима коагуляциитромбина воздействовать на ингибирование фактора активирования коагуляции Х; воздействовать на ингибирование активированного фактора 1 Х;воздействовать на ингибирование активированного фактора Х; воздействовать на ингибирование активированного фактора Х 1; воздействоватьна ингибирование активированногофактора Х 11; пролонгировать длительность коагуляции в ходе проверочногоиспытания на коагуляцию кровянойплазмы по методу АРТТ (продолжитель"ность активированного частичного образования кровяных сгустков); бытьнейтрализованными компонентами кровяной плазмы и влиять на агрегирование тромбоцитов. П р и м е р 2, Ингибирование тромбина,Анализируют способность олигосахаридов усиливать ингибирование тромбина посредством антитромбина 111согласно измененному способу Тееп с сотрудниками, Найдено, что олигосахариды имеют специфическую активность 8 Е/мг в сравнении с 120- 170 Е/мг для "стандартного" гепарина.П р и м е р 3. Ингибирование фактора активирования Х.Способность олигосахаридов усиливать ингибирование фактора активирования Х в плазме и в чистом антитромбине 111 исследуют согласно ви289392 4Нейтрализующее действие компонентов плазмы по отношению к олигоса 1 О 15 20 25 30 35 40 гают разделению с помощью аффинной 55 хроматографии на колонке, содержащейантитромбинсефарозу,1 1ВНИИПИ Заказ 7827/60 Произв.-полигр, пр-тые, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1доизмененному варианту способа Те 1 епс сотрудниками, Показано, что олигосахариды обладают специфическойактивностью 500 Е/мг в системе чистого антитромбина 111 и 1900 Е/мг всистеме плазмы в сравнении с 120170 Е/мг для "стандартного гепарина",П р и м е р 4, Ингибированиефактора активирования 1 Х,Способность олигосахаридов усиливать ингибирование фактора активирования 1 Х в чистом антитромбине 111 исследуют по .Но 1 шег с сотрудниками. Показано, что олигосахариды имеют специфическую активность18 Е/мг в сравнении с 120-180 Е/мгдля "стандартного" гепарина,П р и м е р 5, Ингибированиефактора активирования 1 Х,Способность олигосахаридов уси-,ливать ингибирование Фактора активирования 1 Х в чистом антитромбине 111 исследуют по Но 1 шег с сотрудниками, Показано, что олигосахариды обладают специфической активностью 40 Е/мг в сравнении с 120170 Е/мг для "стандартного" гепарина.П р и м е р 6. Ингибированиефактора активирования Х 11.Способность олигосахаридов усиливать ингибирование Фактора активирования Х 11 в чистом антитромбине111 исследуют согласно Но 1 щег с сотрудниками, Найдено, что олигосахариды обладают специфической активностью 470 Е/мг в сравнении со "стандартным гепарином.П р и м е р 7, Пролонгированиепродолжительности коагуляции,Способность олигосахаридов увеличивать продолжительность времени,требующегося для коагуляцйи у кровяной плазмы, изучают согласно способу АРТТ (время, необходимое дляобразования кровяных сгустков участично активированного тромбопластина). Олигосахариды показывают специфическую активность 12 Е/мг в 5сравнении с гепарином по 3 международному стандарту. Стандартный" гепарин показывает специфическую активность в пределах 120-170 Е/мг.П р и м е р 8. Нейтрализацияолигосахаридов в плазм: крови,харидам получают посредством измерения действия гепарина и олигосахаридов в плазме и в системе чистогоантитромбина, Указанное действиеосуществляют путем измерения количества активирующего фактора Х, ингибированного в двух системах при наличии некоторого определенного количества гепарина или олигосахарида,Показано, что активность олигосахаридов характеризуется 182-ной нейтрализацией компонентов плазмы. Былопоказано, что соответствующая величина для "стандартного гепарина составляет 757,П р и м е р 9, Влияние на тромбоциты,Способность олигосахаридов агрегировать тромбоциты при критических концентрациях ЯР (аденозин дифосфата) изучают в основном по ВесК Е, А. Показано, что способность олигосахаридов к агрегированию тромбоцитов оказалась в 10 раз меньшей, чем у "стандартного" гепарина в весовом исчислении.1 Формула изобретения Способполучения олигосахаридной Фракции, включающей в себя 4-8 моно" сахаридных звеньев, где указанный олигосахарид содержит по крайней ме ре одно 3-0-сульфатированное звено глюкозамина, которое также является 2-0-сульфатированным и 2-Ю-сульфа-, тированным, и где указанные звенья соединены переходным моносахаридным звеном, которое присоединено к восстановленному концу 3-0-сульфатированного звена глюкоэамина, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что гепарин деполимеризуют обработкой азотистой кислотой в диметоксизтане при температуре (-10) С с последующим высаживанием этанолом осадка производных гепарина, после чего его растворяют в 0,05 М растворе хлорида натрия (0,05 М НС 8) при рН 7,4 и полученный раствор подверТирах 369 Подписное