Способ диагностики коклюшной инфекции

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК М 33/53 ВИДЕТЕЛЬСТ И АВТОРСКОМ едоваывороток ге 11 а Йп 1 се Бсапй р. 14 Ьу Епкущеу. -(Е(яа) 1982,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ ОПИСАНИЕ ИЗОБР,1 дА, ЗяЬ апг 1 Ьойдея а 8 адпяг. Вогйереггцяядя шеаяцгес 1й 1 шшцпояогЬепг аяза1. 1 пгесгоп Эея.117-122,(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮШНОЙ ИНФЕКЦИИ(57) Изобретение относится к способамсерологической диагностики инфекционных заболеваний. Цель изобретенияповьппение специфичности способа. Очищенный препарат белковой коклюшнойфракции сорбируют на полистироловомпланшете при рН 7,2-7,4 в 0,1. Мтрис-соляно-кислом буфере. Дезинтег:; раты коклюшного и паракоклюшного микроба липополисахарид коклюша сорбируютв 0,1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе при рН 9,6-9,8. При наличии в исследуемой сыворотке титраантител к липополисахариду 1:1600 ивьппе, а к белковой фракции коклюшных, / микробов и дезинтеграту паракоклюшных микробов ниже, чем к;липополисаха- С риду, диагностируют коклюшную инФекцию,1255929 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к медицине,в частности к способам серологическойдиагностики инфекционных заболеваний,Цель изобретения - повышение специфичности иммуноферментного коклюшного теста для диагностики заболевания.Способ осуществляют следующимобразом.Очищенный препарат белковой коклюшной фракции коклюша сорбируетсяна полистироловом планшете в дозе8-10 мкг при рН 7,2-7,4 в 0,1 Мтрис-соляно-кислом буфере, а дезинтеграты коклюшного и паракоклюшногомикроба и липополисахарид коклюша вдозе 10-15 мгк при рН 9,6-9,8 в 0,1 Мкарбонат-бикарбонатном буфере. Приэтом на одном планшете в стандартныхусловиях получают ответ (учет визуаль яый и инструментальный) о наличии антител ко всем используемым антигвнам, который позволяет судить оналичии инфекционного заболевания.При исследовании антительного ответа у иммунизированных детей,переболевших и больных, установлено,что характер иммунного ответа различен, У привитых детей сохраняютсятитры антител к протективной белковой фракции, а у больных и недавнопереболевших основные антитела образуются к липополисахариду, На этоми основывается диагностика коклюша спомощью ИФА,П р и м е р. Микробную массуВ.регызэ 1 з штамм 305 (100 мл1000 млрд суспензии) дезинтегрируют10 мин с микробусами в баллистичес-ком гомогениэаторе (Л), очищаютот нераэбившихся клеток центрифугированием при 15000 об/мин в течение30 мин,Дезинтеграт содержит 643 Ж белка7,17 углеводов и 10,657 нуклеиновыхкислот, ЕДО = 7,6(2,23 + 12,97) мкгбелка.Получение белковой протективнойфракции коклюшных микробов проводятпо известному способу. В качестве носителя используют планшеты для иммунологических реакций, Затем получают белковую протективную фракцию коклюшных микробов, липосахариды. конюгат известными способами. Сенсибилиэацию планшетов проводят следукццим образом, нанося вертикально в 1 и 5 ряды деэинтегра 1 коклюшных микробов, в 2 и 6 ряды -деэинтеграт паракоклюшных микробов,в 3 и 7 ряды - белковую коклюшнуюфракцию, в 4 и 8 ряды - липополисахарид коклюша, в 9 ряд (контрольный) - бычий сывороточный альбумин,в 10 ряд (контрольный) - растворжелатина, в 11 и 12 ряды (контрольный) - деэиьтеграт коклюшного микроба,В 1-10 рядах раститровывают сыворотки обследуемых. В 11 ряду заведомо положительный контроль (сыворот-ка от больного с бактериологическимподтверждением, проверенная другимисерологическими методами), В 12-мряду раститровывают сыворотку здоровых доноров.Антигены сорбируют при следующихусловиях.Дезинтеграт коклюшный и паракоклюшных бактерий и липополисахаридиспользуют в дозе 10-15 мкг/мл в0,1 М карбонат-бикарбонатном буферерН 9,6 при 37-38 С 2-4 ч, а белковуюфракцию коклюша - в дозе 8-10 мкг/млв 0,1 М трис-соляно-кислом буферерН 7,2-7,4 2-4 ч при 38-37 С. Исходное разведение сыворотки обследуемых 1:200, шаг разведения двукратный. Постановка ИФА осуществляется известным способом (Е 1,)БА. Учет реакции ведется визуально или инструментально при длине 449 нм. Реакция считается положительной, если разница между контролем и опытным образцом равна или более 0,1, При визуальном учете положительной реакции считается, та, которая по окраске отличается от контроля на два разведения (лунки). Диагностический титр ИФА при заболевании коклюшем 1:1600 при реакции на ЛПС. У больных людей титр к ЛПС 1:1600 и выше при более низком или равном титре к белковому компоненту. У привитых детей наблюдают высокие титры к белковой фракции и снижение к липополисахариду. При заболевании паракоклюшем титр антител к дезинтеграту паракоклюша вьппе не менее, чем на три разведения, чем к коклюшному дезинтеграту и его компонентам. При массовом обследовании возможно использовать всего 2-3 разведения5929 4 Формула изобретения 125 Составитель Н. КузенковаТехред Л.Сердюкова КорректорМ. Демчик редактор Н, РогуличЗаказ 4816/44 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3сыворотки, начиная с титра 1:1600 Все значения реакции с ЛПС коклюша выше 1:1600 при более низких или равных титрах к белковой фракции коклюша и его дезинтеграту свидетельствуют о ,наличии коклюшной инфекции. Тест рекомендован для диагностикикоклюша и оценки поствакцинальногоиммунитета. 1 О Предлагаемый способ позволяет с помощью ИФА-коклюша (теста) различать привитых детей от больных и переболевших, отдифференцировать коклюш 15 от паракоклюша, ставить диагноз даже при слабом антительном ответе (по разнице титров к ЛПС и белку) пациента, а также для выявления стертых форм заболевания, носительства. Кроме 20 того, тест подтверждает наличие заболевания в 95 случаев (при подтверждении бактериологическом) и 80-853 при клиническом диагнозе (больные с подозрением на коклюш без бактери ологического подтверждения). Способ диагностики коклюшной инфекции путем иммобилизации на планшете дезинтегратора коклюшных микробов сыворотки больного, кроличьих антител к гамма-глобулину человека, меченных пероксидазой хрена, с последующей. оценкой реакции по интенсивности окраски, субстратной смеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности способа, в качестве антигенов дополнительно используют липополисахарид коклюшных микробов, дезинтеграт паракоклюшных микробов в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6-9,8 и белковую фрак" цию коклюшных микробов в 0,1 М триссоляно-кислом буферном растворе, и при наличии в исследуемой сыворотке титра антител к липополисахариду 1:1600 и выше, а к белковой фракции коклюшных микробов и дезинтеграту паракоклюшных микробов ниже, чем к липополисахариду, диагностируют коклюшную инфекцию.