Способ выделения белковой фракции

(72) С.А. (53) (56) в ра лектрофорезеских макромос. 153. лек БЕЛКОВ АКсится к методам ств биологичеспозволяет повы целевого проической камере ныи буферныи оставляющихзначениями р УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗО ОРСКОМ СВИДЕтеп(57) Изобретениефракционирования щкого происхождения исить степень очисткидукта. В злектрофореформируют разделителраствор в виде двухрастворов с заданными(50 4 С 01 М 27/26 33 6 БРЕТЕНИЯ каждый раствор вводят последовательно. Биопрепарат вводят в раствормежду составляющими разделительногобуферного раствора, рН составляющихразделительного буферного раствораи биопрепарат берут с заданным соот"ношением: рН 1 срН(рН рНз = Р 1 оьР 1 урн ср 1; р 1,рн,р 1; где рнрН - рН составляющих разделитель"ного буферного раствора; рНз - рНбиопрепарата; р 1 - величина изоточки выделяемого компонента биопрепараа; р 1 - максимальная величинаизоточки компонента из группы примесных компонентов биопрепарата со значением, меньшим рН,; р 1 " минималь"ная величина изоэлектрической точкикомпонента из примесных фракций белкового препарата со значением, большим рН. 4 ил.129 б 919 где рН,рН рН,р 1,1Изобретение относится к электромиграционным методам фракционирования веществ биологического происхождения и предназначено для очисткибиологических веществ, в основномбелков, электрофорезом в фармакологии, биохимии, молекулярной биологии, сельском хозяйстве и другихобластях,Цель изобретения - повышение степени очистки целевого продукта путемформирования разделительно буфернойсмеси из буферных растворов с определенным соотношением значений рН,На фиг.1 показано распределениебуферов в колонке до ввода биопрепарата; на фиг,2 - то же, после ввода биопрепарата; на Фиг,З - процессфореза при ориентации буфера с наименьшим рН к отрицательному полюсу,а с наибольшим рН к положительному;на фиг.4 - то же, с наименьшим рНк положительному полюсу, а с наибольшим рН к отрицательному, гдеобозначено: НА - гемагглютинин;ОА - овальбумин; М - белок М; БА -нейтраминидаза; Т -Т - различныемоменты времени.Способ осуществляется следующимобразом,В электрофоретической (рабочей)камере формируют разделительный буферный раствор в виде двух составляющих растворов с заданными значениями рН путем последовательноговведения каждого раствора, Биопрепарат в растворе вводят между составляющими разделительного буферногораствора, при этом рН упомянутых составляющих разделительного буферногораствора и раствора биопрепарата берут с заданным соотношением р 1 р 3 р 7 р 3 р О р 1 рН р 1р 1 рН р 1 рН составляющих разделительного буферного раствора;рН биопрепарата;величина изоточки выделяемого компонентабиопрепарата,"максимальная величина изоточки компонента из группы примесныхкомпонентов биопрепарата со значением, меньшим рН,; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2р 1 - минимальная величинагизоточки компонента из группы примесных компонентов биопрепаратасо значением, большимрНПри этом составляющие разделительного буферного раствора ориентируют соответственно с минимальным рНк отрицательному электроду, с максимальным рН - к положительномуэлектродуПосле введения разделительных буферных растворов и раствора биопрепарата на колонку подается напряжение, При этом на электрод со стороныбуферного раствора с рНрНз (т,е,более щелочного или менее кислотного,чем рН раствора биопрепарата) подается положительный заряд, а на электрод со стороны буферного растворас рНрН з (т.е. менее щелочного илиболее кислотного, чем рН растворабиопрепарата) подается отрицательныйзаряд, В этом случае находящийся визоэлектрической точке компонентбиопрепарата не имеет заряда и егочастицысоответственно, не подвергаются электрофорезу. Примесные компоненты, частицы которых имеют положительный или отрицательный заряд, начинают двигаться к электродам противоположного знака и попадают в средус рН, которая вызывает еще болеесильную диссоциацию их, т,е, увеличение соответствующего заряда, чтоприводит к ускорению движения от места в сторону соответствующего электрода, В результате в месте ввода остается только выделяемый компонентбиопрепарата, а все примесные компоненты, частицы которых имеют положительный или отрицательный заряд,удаляются в разделительные буферныерастворы, Отбор заданной фракции производится из зоны ввода биопрепарата,П р и м е р 1, Выделение гемагглютинина вируса гриппа Х/Ленинград/54из обогащенного дезинтеграта, содержащего помимо гемагглютинина такжебелковые примеси (овальбумин, гликопротеид-белок М и нейтраминидазу),Известные значения изоэлектрическихточек этих белков составляют: гемагглютинина р 1 = 5,8, овальбуминар 1, = 4,5, белка М р 1, = 5,0, нейтраминидазы р 1 7,5. Готовят буферныерастворы (например, трис-боратные)со следующими значениями рН: буфер3 12с рН 5,5, т,е, со значением меньшим,Цчем р 1 но большим, чем р 1 и р 1,1чтобы примесные белки эвальбумин ибелок И имели подвижность, но не достигли изоточек (р 1 рН,р 1, ); буферс рН 7,0, т.е, со значением большим,чем р 1 , но меньшим, чем р 1 , чтобыпримесь нейтраминидазы имела подвижность, но не достигла изоточки(р 1 срН р 1 ),Буфер с рН заправляется в нижнююполовину камеры разделения колонки,Затем верхняя половина камеры разделения заполняется буфером с рН.Раствор исходного белкового препарата с гемагглютинином титруется,например, трис-боратом до величинырН, равной значению иэоточки гемагглютинина (т.е, рНз= р 1 = 5,8). После чего раствор с рНэ с препаратоввводится в камеру разделения в зонумежду буферами рН и рН, Затем наколонку подается напряж ние постоянного тока. Иолекулы всех белков врастворе приобретают поверхностныйзаряд, однако знак заряда (положительный или отрицательный) за счетамфотерных свойств белков может бытьтот или иной в зависимости от того,больше или меньше рН среды относительно значения иэоточки, а величиназаряда тем больше, нем больше разница между значениями изоточки р 1данного белка и рН среды, В приведенном выше примере в исходной зоневведенного белкового препарата с рНзаряд гемагглютинина равен нулю(так как рН = р 1 О), овальбумин ибелок И заряжаются отрицательно (такНкак рН р 1, и р 1 ), а нейтраминидаэа - положительно (так как рНср 1) .Тйким образом, для удаления иззоны неподвижного гемагглютинина сопутствующих белковых примесей, иэоточки которых имеют значения большеи меньше, чем у очищаемого белка,при формировании разделительной буферной системы в колонке составляющиеэтой системы взяты в соотношении.рН,рНсрН. При невыполнении этогосоотношения не обеспечиваются условиянеподвижности очищаемого в зоне вводапрепарата при безостановочном движении всех примесных белков,При ориентации более кислого буфера рН к отрицательному электроду, а более щелочного рН к положительному нейраминидаза двигается к от 96919 4 нина замедляется, а скорость движения белка М, имеющего значение изоточки114 рЕ , очень близкое к изоточке р 1 Офгемагглютинина (равный рНз), незначительна, в данном примере соизмерима с диффузионным движением (размыканием) границ зоны рНз в стороны буферных растворов, При этом ввиду близости значений изоточек выделяемого белка и примесных белков в данном примере при обратной полярности электродов относительно буферов (т,е, при ориентации рН к плюсу, а рН к минусу) снижается степень очистки белка гемагглютинина и увеличивается время процесса,35 40 45 50 П р и м е р 2, Выделение сывороточного альбумина человека из белковой смеси, содержащей патологические функции алюбумина и гемоглобина, Значения изоэлектрических точек этих белков составляют: нормального сывороточного альбумина (очищаемого)р 1 д = 5,3, патологически измененныхизомеров альбумина в диапазоне р 14, 0-4, 1, иэомеров гемоглобина вдиапазоне р 1 = 7,0-7,3. рицательному полюсу, а овальбумин ибелок М - к положительному, Гемагглютинин.остается неподвижным, На границах зоны рН с буферами рН, и рН 2происходит скачкообразное увеличениеэлектрофоретических подвижностей примесных белков нейраминидазы, овальбумина и белка М, которые удаляютсяс повышенной скоростью от зоны ге 10 магглютинина и собираются на концахкамеры разделения,После окончания процесса форезапроизводится отбор зоны рНэ, котораясодержит очищенный гемагглютинин,15 В приведенном примере при обратной полярности электродов относительно буферов, т,е, при ориентацииминимальным рН к положительномуэлектроду, а максимальным рН к от 20 рицательному - миграция примесныхбелков овальбумина, белка М и нейра.минидаэы происходит в обратных направлениях, Гемагглютинин остаетсянеподвижен . Однако на границах зонырНу с буферами рН и рН происходитскачкообразное уменьшение зарядовпримесных белков и, соответственно,скачкообразное уменьшение их электрофоретических подвижностей и удаление этих белков от эоны гемагглюти 5 12969Готовят буферные растворы (например, трис-боратнополимерное) со связующими значениями РН: буфер с РН, 4,8 (из условия, что и в примере 1 Р 1 р РН)Р 1,); буфер с РНг 6,0 (также, как в примере 1, из условия р 1 с, РН,-Р 1,).Буфер с РН заправляется в нижнюю половину колонки, с РНг - в верхнюю половину, а раствор биопрепарата, от- О титрованный (например, трис-боратом) до РНр 1 = 5,3, вводится в колонку между буферами РН, и РНг, Затем на электроды колонки подается напряжение, В данном примере нормальный альбумин не имеет заряда и остается неподвижным в зоне ввода (так как РН = р 1 ). Патологические изомеры альбумина заряжаются отрицательно (так как РН)р 1,), а изомеры гемоглоСина положительно (так как РН,Р 1,).Таким.образом, для обеспечения условий неподвижности очищаемого белка в зоне ввода, при непрерывном уда 25 лении от него нежелательных примесей, составляющие буферной системы взяты в соотношениях30РН РН срНПри ориентации более кислого буфера РН, к отрицательному полюсу, а более щелочного РНг к положительному гемоглобин двигается к минусу, а па тологические иэомеры альбумина - к плюсу, Но на границах зоны РН с буферами РН и РНг электрофоретические.подвижности всех примесных белков скачкообразно возрастают, соответст- ф венно, и скорости удаления от зоны ввода. Примесные белки собираются наконцах камеры разделения, после чего производится отбор эоны РНз, содержащей иормальный очищенный альбумин,В дриьере 2 при изменении полярности электродов относительно буферов РН и РНг (т,е, при ориентации РН, к плюсу, а РН к минусу) миграция 50 примесных .белков происходит в обратных нвправлрниях, но нормальный альбумин остается неподвижен (так какего заряд равен нулю при РНз = Р 10)При этом на границах зоны РН с бу ферами РН и РНг,ввиду уменьшения зарядов примесных белков (так как значения РН растворов ближе к ихр 1), происходит скачкообразное умень 19 6шение их подвижностей, Однако ввидутого, что значения изоточек примесейдалеки от значения р 1 с очищаемогобелка, существенного снижения скоростей движения примесных белков непроисходит, а лишь удлиняется времяпроцесса беэ заметной потери качества отбираемой фракции нормальногоальбумина,П р и м е р 3, Выделение гемагглютинина вируса гриппа штамма А 2/Ленинград/385 из дезинтеграта гельфильтрационной очистки, содержащего помимо гемагглютинина А 2 также белковыепримеси: овальбумин, гликопротеид -белок М, нейраминидаэу А 2 и алантоисный гликопротеид. Значения изоточек этих белков составляют; гемагглютинина А 2 Р 1 р = 7,1, овальбумина1р 1, = 4,5, белка М р 1, = 5,0, нейраминидазы А 2 р 1 г = 8,0, алантоисногоПгликопротеида р 1 = 8,5.Готовят буферные растворы (например, трис-боратглицериновые) со следующими значениями РН: буфер с РН,6,8 (из условия, что и в примере 1Р 1 РН р 1); буфер с РН 7 3 (каки в примере 1 из условия р 1 срНг,р 1 г)1Буфер с РН, заправляется в нижнююполовину колонки, с РНг - в верхнююполовину, а раствор биопрепарата,оттитрованный (например, трис-боратом) до РН = р 1 = 7,1, вводитсямежду буферами РН, и РНг, Затем наэлектроды колонки подается напряжение,В данном примере гемагглютинин А 2 незаряжен и остается неподвижен в зоневвода (так как РН =- р 1), овальбумин и белок М заряжаются отрицательно (так как РН )р 1, и р 1 ), а нейраминидаза А 2 и алантоисный гликопротеид - положительно (так как РН ср 1Иги Р 1 )Таким образом, для обеспеченияусловий, при которых выделяемый белок останется неподвижным, в стартовой зоне, а примесные белки различного заряда имеют электрофоретическуюподвижность на всем пути миграции ихот стартовой эоны до полюсов, составляющие буферной системы взяты всоотношениЯх РНсРНзсРН . ПРи оРиентации минимальным РН к отрицательному электроду, а максимальнымРН к положительному движению пригмесных белков: овальбумина и белка М - происходит к плюсу, а нейраминидазы А 2 и алантоисного гликопро.7 12969теида - к минусу. Гемагглютинин А 2остается на месте. При миграции примесных белков из зоны ввода на границах зоны РН с буферами РН и РНподвижности этих белков скачкообразно возрастают. В ходе процесса примесные белки с повышенной скоростьюотходят к концам камеры разделения,По окончании процесса фореза производится отбор зоны РН, содержащий Оочищенный гемагглютинин А 2,В примере 3 при изменении полярности электродов относительно буферов РН и РН (т,е. при ориентации РН, к плюсу, а рН к минусу) 15миграция белков примесей происходитв обратных направлениях, гемагглю-тинин А 2 по прежнему остается наместе ввода (так как его заряд равеннулю при рН = р 1 О). Однако при миграции примесей из зоны ввода РН награницах зоны РН з с буферами РН,и рНс происходит скачкообразное уменьшение их подвижностей, При этом замедляется движение овальбумина, белкаМ, алантоисного гликопротеида, а нейраминидаза А 2 имеет незначительнуюподвижность (ввиду близкости ее изоточки с величиной изоточки р 1 О). Врезультате по сравнению с первоначальной полярностью электродов процесс очистки от овальбумина, белка Ми алантоисного гликопротеида происходит, но медленнее, а качество очистки от нейрамйнидазы А 2 ухудшено ввиду того, что скорость ее движенияоказывается соизмеримой с диффузионным движением (размыванием границзоны рН в стороны буферных растворов), В данном случае этого примера 40по окончании процесса из зоны вводаотбирается гемагглютинин А 2, которыйхорошо очищен от примесных белкововальбумина, белка М и алантоисногогликопротеида, но значительно хуже 45очищен (чем при ориентации рН 1 к минусу, а рН к плюсу) от нейраминидазы А 2, Однако, поскольку для практических целей присутствие гемагглю Формула изобретения Способ выделения белковой фракции путем введения белкового препарата между буферными растворами разделительной буферной смеси, состоящей из нескольких буферных растворов, с последующим электрофорезом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта, при формировании разделительной буферной смеси рН составляющих ее буферов устанавливают в соответствии со следующими соотноше- ниями рНсрН срН, рНэ = р 1р 1 сРНср 1Р 1 О РНР 1, ф где рН рН величины РН составляющих разделительнойбуферной смеси;величина рН растворабелкового препарата;величина изоэлектрической точки компонента выделяемой фракциибелкового препарата;максимальная величинаизоэлектрической точки компонента из примесных фракций белкового препарата со значением, меньшим РН,минимальная величинаизоэлектрической точкикомпонента из примесных фракций биопрепарата со значением,большим рН рН5 р 1О р 1 19 ,8нитина совместно с нейраминидазой яв,ляется безвредным или дазе желательным (наприме, для создания молеку 1 лярных вакцин и антисывороток), данный вариант ориентации полярности электродов и буферов в примере 3 является допустимым,уса па) ддпд искпд исгю Ю ОА И ФдИ 1296919 60 У,Эстер 4 ада айаю ЮУЮВВЮ- еииан иота 4Овчар 0 ЮЩРНН 0,- гп Вещиге129 б 919 оставитель Н, Гуляеваехред И.Попович ектор Г.Решетник Редактор Н,Киштули Подписное Тираж 777 Государственного елам изобретений ква, Ж, Раушск омитета СС открытий