Способ получения рибои дезоксирибонуклеозид-5 трифосфатов, меченных изотопами с и н

5 Г РпЯ,г ОБ Я Т ЛЬСТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ Н 3 МИТЕТПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬТИЯМпРи пят ссо ОПИСАНИЕ ИК АВТОРСКОМУ СВИ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институтбиологически активных веществ(дезокси) аденилаткиназу, (дезокси)гуанилаткиназу, (дезокси) цитидилатИзобретение относится к области биоорганической химии, конкретно к способам получения рибо- и дезокснрибонуклеоэид-трифосфатов, иеченых нзотопами "С и з Н, которые щироко применяются в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях.Целью изобретения является упрощение процесса и повьвение выхода целевого продукта.П р и и е р . Получение комплек сного фериентного препарата.Биомассу Е. со 11 В, инфицированную иутантиыи фагои Т 4 аа Р 82 (с мнозест венностью заращения 4), хранящуюся прн -40 С, измельчают в ступке, заливают трехкратныи объемом 0,1 М КС 1 и кинаэу, уридилаткиназу и тимидилаткинаэу, иэ,биоиассы Е. со 1., фосфорилирование рибо- и девоксирибонуклеоэид- -5-монофосфатов, меченных иэотопамиС или Н, с помощью ферментного препарата с добавлениеи в реакционную+ смесь ионов М 8ацетилфосфата, АТФ или дАТф и буфера.тряс-НС 1 рН 7,5, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повыиения выхода целевого продукта, все укаэанные ферменты использую".виде иммобилизлванного на Вг-СК-Сеароэе комплексного ферментного препарата, выделенного иэ биомассы Е. со 11 В, инфицированной мутантным фагом Т 4 ал В 82, об-Ж работкой клеточного экстракта стрепто иицинсульфатои и последующии фракционироваиием сульфатом аммония при концентрации его 70-302 от насыщения. 0,05 М .трис-НС 1 рН 7,5, содержащем ьеый 2 иМ 2-меркаптоэтанола, перемешивают при 2-5 С до образования однородной р суспенэни, затем приливают раствор лизоцииа в 0,05 М трис-НС 1 рН 7,5 (иэ расчета 1 мг лиэоцима на 1 г биомассы) и перемешивают при 2-5 С в течеоние 10 инн. После этого суспензоо озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом деэинтеграторе (18 кГц) сеанса- а ми по 1 мин с перерывами в 1 мин. Об- ф щее время озвучивания 20 мин. Суспеи- кафф эг центрифугируют в течение 40 мин при 10000 об/мин, Осадок отбрасывают.К супернатанту приливают по каплямпри тщательном перемещивании 303-ный раствор стрептомицинсульфата в 0,05 Мтрис-НС 1 рН 7,5, содержацем 2 мМ 2 - меркаптоэтанола, до конечной концентрации стрептомицинсульфата 37. ПослеС этого смесь перемешивают при 2-э С н5 течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 40 мин при 12000 об/мин, Осадок отбрасывают. К супернатанту при тщательном перемешивании на холоду присыпают небольшими порциями тонкорастертые кристаллы сухого сульфата аммония до конечной концентрации 707 насыщения по сульфату аммония. Раствор тщательно перемешивают в течение 30 мин на холоду, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 10000 об/мин. Супернатант отбрасывают. Осадок суспендируют в минимальном объеме раствора сульфата аммония с концентрацией 701 от насыщения в 0,05 М трис-НС 1 рН 7,5, содернащем 2 мМ 2-меркаптоэтанола, Суспенэию раэбавляют в 2,5 раза с буфером и тщательно перемешивают на холоду в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 30 мин при 25 12000 об/мин, Осадок отбрасывают. Супернатант подтитровывают с 0,5 н КОН до рН 7,5 и используют как комплексный ферментный препарат. Полученный ферментный препарат разливают по 5 мл в герметичные полиэтиленовые флаконы и заморанивают при -40 С. В таком виде препарат хранится 6 мес. беэ заметной потери активности.П р и м е р 2. Синтез рибонукле 35 оэид- и деэоксирибонуклеоэид-трифосфатов, меченных иэотопами С ии Н, с использованием комплексного ферментного препарата.Перед использованием в синтезе комплексный ферментный препарат иммобилиэуют известным способом на Вг-СБСефароэ е, Для этого 5 мл ферментного препарата раэморанивают на льду, обессоливают (от сульфата аммония)45 на колонке с Сефадексом Г(1,6 см х х 40 см) с одновременной эаменой бу фера на 0,1 М К-фосфат рН 7,8, содерхащий 0,5 М КС 1 и 2 мМ 2-меркаптоэтанола, В последнем буфере проводят иммобилизацию при соотношении белка50 и матрицы 15 мг/г сухой матрицы. Хранят иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) в 0,01 М трис-НС 1 рН 7,5, содернащем 2 мМ 2-меркаптоэтанола, при 2-5 С в герметичной посуде в течение 4 недель без потери активности.а) Синтез уридин- трифосфата,Реакционную смесь, содержащую в1 мп 2 мкмоль ЯС- или Н-уридин--монофосфата 0,2 мкмоль АТФ,20 мкмоль ацетилфосфата, 4 мкмольМ 8 С 1, 50 мкмоль трис-ЙС 1 рН 7,5,ИФП, содержащего 0,4 мг белка, инкубируют в термостатируемой встряхиваемой кювете при 37 С в течение 2 ч.Затем реакционную смесь отделяют отИФП на стеклянном фильтре, упариваютпри 30 фС на ротационном испарителедо объема около 0,1 мл и наносят напластины Силуфола УФ(15 см хх 15 см), предварительно промытыеацетоном и высушенные в вакуумном эксикаторе. Проводят восходящую хроматографию в системе 1,4-диоксан - 5 Маммиак -М ацетат аммония 43:54:3)Зоны расположения нуклеотидного материала идентифицируют под ультрохемископом; полосы, содержащие С- или3П-УТФ, вырезают и элюируют С- или3Н-УТФ с пластины водой, Элюат фасуютво флаконы, добавляют этанол до концентрации 503 и хранят при -20 С.Выход С или Н-УТФ в синтезе составляет 94-963.б) Синтез аденоэин-трифосфата.В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль " С- или Н-аденозин-монофосфата, В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-трифосфата. Выход 4 С- илиЗН-АТФ в синтезе составляет 82-897,в) Синтез гуаиозин-трифосфата.В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- или эН-гуанозин-монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-трифосфата. Выход 4 С- или зНГГФ в синтезе составляет 82-892,г) Синтез цитидин-трифосфата.В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль мС- или эН-цитидин-монофосфата. В остальном про;цесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-трифосфата, Выход 4 С" илиН-Ц 7 Э в синтезе составляет 70-723.д) Синтез деэоксиаденоэин-трифосфата,В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль и С- или Н-деэоксиаденознн"монофосфата. ВместоЛТФ в качестве донора фосфатных группв реакционную смесь вносят дАТФ. ВЗаказ 6865 Тираж 339 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10 остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-трифосфата. Выход мС- или Н-дАТФ в синтезе составляет 8 -833.5е) Синтез деэоксигуаноэин-трифосфата.В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- или Н-дезоксигуанозин-монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридии-трифосфата. Выход 4 С- или Н-дГТФ в синтезе составляет 90-927,ж) Синтез дезоксицитидин-трифосфата.В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- или Н-дезоксицитидин-монофосфата. В осталь ном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-трифосфата. Выход 4 С- или Н-дЦТФ в синтезе составляет 62- 653. 25(з) Синтез деэокситимидин-трифосфата.В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль цС- или Н-дезокситимидин-монофосфата. Хроматогра О фию реакционной смеси на пластинахСнлуфол УФпроводят в системеизомасляная кислота - 5 М аммиаквода (57:4:39). Полосу Сипуфола УЮ254, содержащую фС- или эН-ТТФпромывают зтанолом для удаления следов изомасляной кислоты, высушиваюти затем злюируют целевой продукт водой. В остальном процесс синтеза иочистки конечного продукта аналогиченописанному для уридин-трифосфата.Выход фС- или Н-дТТФ в синтезе составляет 88-823. Радиохимическая чистота полученных препаратов составляет 94-963. Основные характеристики Успектров полученных рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозид-У -трифосфатов соответствуют характерньи для них. Полученные препараты +С-АТФ и С-УТФ были испытаны в ферментативной системе РНК-полимеразы Е. со 11, а препарат 4 С-дТТФ - в системе терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераэы иэ тимуса теленка. Во всех случаях включение полученных4 С-нуклеозид-трифосфатов не уступает включению аналогичных препаратов фирмы "Авета Ьаа",