Способ определения степени деструкции эритроцитов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК св 9(51) 4 С 01 Б 33/ ИЗОБРЕТЕНИЯИДЕТЕЛЬСТВУ С К АВТОРСК биоло РязанОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт прбблем криои криомедицины(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИДЕСТРУКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ путем инкубации их в среде с последующей регистрацией изменений физико-химических свойств этой среды, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа,регистрируют рН среды, при этом вкачестве среды используют изотонический раствор неэлектролита, непроникающий в клетки, а степень деструкции эритроцитов рассчитываютпо номограмме,.Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для определения степени повреждения эритроцитов при ряде патологических состоя.ний. 5Целью изобретения является ловышение точности и упрощение способаза счет использования изотоническойсреды, содержащей неэлектролит, не,проникающий в клетки, при этом регистрируются слабые повреждениямембран, степень которых определяется по изменению проницаемости дляфионов НСпособ осуществляют следующим 15образом.Исследуемую суспензию клеток вносят в ячейку серийного рН-метра,содержащую изотонический раствор непроникающего в клетки неэлектролита 20с физиологическим рН (7,4), тоничностью, соответствующей тоничности,исследуемой суспензии. При этом развивается диффузионный потенциал ипроисходит сопряженный выход анионов С и катионов Н . В результатеэтого через 20-40 с наблюдается увеличение рН, которое регистрируетсярН-метром, Если мембраны клеток повреждены, рН среды увеличивается ЗОпропорционально количеству разрушенных клеток.Количество поврежденных клеток Юопределяют по формулеЮ= 00%-(-д - -ш х 100%), (1) 35и трН -рНгде рН - константная величина рН,принимаемая для эритроцитов за 7,0, определяетсяпутем внесения в измерительную ячейку с физиологическим раствором (рН 7,4)0,2 мл контрольной суспензии эритроцитов;рН -рН в измерительной ячейкеДдытпосле внесения суспензии,подвергнутой действию экстремального фактора;фрН - рН в измерительной ячейкепосле внесения контрольной50суспензии клеток. В стандартных условиях при постоянном или близком к постоянному гематокрите и для определения групп крови рН, является константной величиной, что позволяет в целях ускорения опыта построить соответ,ствующие номограммы и определить степень деструкции эритроцитов йе- посредственно по величине рН в измерительной ячейке.П р и м е р 1, В измерительную ячейку стандартного рН-метра, содержащую 10 мл 0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспензии ннтактных эритроцитов в плазме крови (гематокрит 77% и регистрируют измерение рН. Через 20 с после начала измерения наблюдают максимальное рН 5,57. К новой порции средыизмерения добавляют 0,2 мл эритроцитов, подвергнутых медленному замораживанию до -5 и 7 С и последующему отогреву в водяной бане при 37 С.При этом регистрируют максимальное рн 6,1 .(замороженных до -5 С) и 6,65 (замороженных до -7 С), Вычисленное по формуле(1) количество клеток, подвергнутых деструкции, составило соответственно 37,1 и 75,6%.Построение номограммы. В измерительную ячейку, содержащую 10 мл 0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспензии эритроцитов, полученной смешением в различном соотношении интактных клеток (гематокрит 77% )и клеток, полностью разрушенных двухкратным замораживанием - огтанванием, что контролируют по гемолизу. Максимальное рН (см.чертеж), зарегистрированное через 20 с, увеличивается пропорциональ-, но уменьшению в суспензии количества целых клеток. Приведенная на чертеже зависимость рН среды от количества интактных клеток при данном гематокрите является номограммой для вычисления степени деструкции клеток после воздействия экстремального фактора, не связанного с внесением химических реагентов (щелочей, кислот и т,п.), существенноизменяющих рН или обладающих большой(более 2 М) буферной емкостью.П р и м е р 2, В измерительнуюячейку, содержащую 10 мл 0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспензии эритроцитов (гематокрит 80%), подвергнутых нагреванию до температур 37, 49 и 54 фС, выдержанных при этих температурах 1 О мин и охлажденных до комнатной температуры. Зарегистрированное максимальное рН среды составляет 5,58, 6,07, 6,25 соот.ветственно, что по номограмме чертежа означает деструкцию 1,5, 37,5 и 53,5% клеток.1250952 П р и м е р 3. В измерительную ячейку, содержащую 10 мл 0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспенэии эритроцитов (гематокрит 773). Зарегистрировано максимальное рН 5,60, Затем в измерительную ячейку с новой порцией сахарозы вносят 0,2 мл эритроцитов, предварительно обработанных в течение 5 мин 0,057-ным тритоном Х. Регистрируемое при этом рН составляет 5,9, что по номограмме чертежа означает деструкцию 247. клеток..Номограммы зависимости рН среды от количества клеток при данном ге 1 О Я,2 Я,1 рМ Ю 4- бб ставитель А. Агуреевхред И.Гайдош Коррек Редак елемеш,Рошко каз 4403/3 Тираж сударственног м изобретений ква, Ж, Ра одпис ВНИИПИ по д 13035, СССР комит открытийская наб., д изводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужго ктная ф Ътса Ъ )( Ь Ъ за мотокрите строят для каждой используемой среды инкубации. Использование предлагаемого способа позволяет регистрировать деструкцию клеток при дефекте мембран меньше 4-5 А (по способу-прототипу измеряют дефекты не менее 80 А). Точность способа не снижается при измерении в среде инкубации с криопротектором, Упрощение способа дости гается эа счет изъятия процедуры спектрофдтометрической регистрации уровня гемоглобина в среде.