Способ определения отрицательных зарядов на поверхности клеток эритроцитов

-й 11 осковск38й государственный ут им, Н.И. Пирог едицинскии инсти 72) Н. ЗахарчЗахарова 1,01(088 РМя 1 о(54) СПОСОБЗАРЯДОВ НА ПЫИТОВ(7) Изобретение ится к медицине медицине, остныхсорбциониспользо" отрицательверхности атологичес- сахарном яЛеигде М арядов я крас иниц Спосотельныйэритроциположителсителя иС ростомраствореприближа цаи Осякраи экихостьЭтим концентра эри троцит обусловле нщ СУДАРСТВЕКНЫЙ КОМИТЕТ 0 ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТРИЦАТЕЛЫЫХ ОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ЭРИТРОИзобретение относится ка именно к изучению поверхнслоев клеток эритроцитов адными методами, и может бытьвано для определения числаных зарядов на клеточной поэритроцитов в норме и при пком состоянии, например придиабете.Цель изобретения - ускорение и упрощение способа - достигается тем, что отмытую эритроцитарную массу смешивают с раствором катоннрго красителя в концентрации 4,3-27 г/м при соотношении объемов 1 фЭ и инкубируют в течение 2-3 ч при 18-22 С, отделяют эритроциты от раствора, который фотометрируют, По значению адсоборции красителя проводят расчет числа зарядов на клеточной поверхности эритроцитов, исходя из формулы и может бысть использовано для определения отрицательных зарядов на клеточной поверхности эритроцитов в нормеи при патологических состояниях, например при сахарном диабете. Цельюизобретения является упрощение и ускорение способа, Отмытую эритроцитарнуюмассу смешивают с раствором катионного красителя в концентрации 4,327 г/и при соотношении объемов 1;)инкубируют 2-3 ч при 18-22 С, отделяютэритроциты от раствора, который фотометрируют. По значению предельной адсорбции красителя проводят расчетчисла зарядов на клеточной поверхности эритроцитов. 1 ил., 1 табл. число отрицательных на один эритроцит;11 А - постоянная Авогадро в - предельная адсорбци ля, моль/м 1и - число эритроцитов в объема. основан на том, что отр ряд клеточной поверхнос в полностью нейтрализуе ным зарядом катионногоего предельной адсорбц онцентрации красителя в го адсорбция асимптотич тся к предельнои. При циях красителя поверхн ов далека от насыщения выбор нижнего предел;1 - обьел изотоницеского растворакрасителя, иТаким образом;- б6,023 1( 1 9 10 90 10/.)- ,9 1 о центрации используемого красителя в растворе. При концентрациях красителя, больших 30 г/л, происходит насыщение раствора красителя, имеющего органическую растворимост в изотоницеском растворе хлорида натрия. Адсорбцлонное равновесие достигаетсп за 2-3 ч при 18-22 С.Способ поясняется примерами.П р и и е р 1, Эритроциты, выделенные из донорской крови практически здоровых людей, трижды отмывают изотоницескии раствором (0,15 М) хлорида натрия, при рП .= 7,2. Для отмывки на 1 лл эритроцитарной массы берут 3 мл растаора хлорида натрия. После центриФугирования 1 мл эритроцитдр ой иассь добавляют к 9 мл кр: - сителя кдтионного синего 0 с концентрацией красителя 27 г/мв изотоническои растворе при указаном выше рН, в"тряхиваюг и выдерживают полученную суспензию 3 ч при 18 С, Отделяют эритроциты о растворд центриФугировднием. После адсорбции раствор фотометрируют при п 0 ни. Измерения проводят натокогорииетре Ю(-2.1 р дель 1 ая концентрдця адсорбиро" в;нного красителя составила 1/и3Число отрицательных зарядов, оцениваемое как равное числу зарядов красигеля (относительный заряд одной мол- улы ьрдсител равен + 1) рассчи тывдпи по ф,рмуге П р и и е р 2. 1 мл эри"роцитарноймассы, выделенной и отмытой по примеру 1, добавляют к 3 мл изотоническогораствора красителя содерндщегол,3 г/м кдтионного синего 0. Полуцен 3ну д суспензию встряхивдют, вьдерживают 3 ч и повторяют методику определения количества красителя, поглощенного клетками, описанную в примере 1,Предельная конце 1 трация ддсорбированного красителя равна 2,35 г/л.Чисго отрицательных зарядов припредельной адсорбции 0,261 о .П р и и е р 3, 1 ил эритроцитарнсй кассы, выдег 1 енной и отиьтой попримеру 1, добавляют кил изотоничсского рдстворд красителя кдтионногс синего О, содержащего 15,6 г/лвстряхивают, выдерживают полученнуюсуспензию 3 ч и повторяют методику опрд-.ле 1 ия количества красителя, поглощнного клеткали, описанную в прилер 1.Предельная концентрация адсорбиропднного красителя оавнд 11,7 г/мчисло отрицательных зарядов припрдльно 1 дсорбц 1 и 1,710 Г,П р и и е р 1. Эритроциты, выдегенные и отмытые по примеру 1, отвержда"ют глутаровым альдегидом следующим образом, Б эритроцитдрную массу добавляю отвердитель (100 ил 1 1-ного раствора на 10 ил эритроцитов), инкубируютсутки при 0- С, избыток глутаровогоапьдогида удаляю обработкой 0,15 Мраствора глицина, После отделенияэритроцитарной массы ее отмывают изотоническии раствором, как указано вприлере 1. 1 мл эритроцитарной массыслешивдют с 1 мл изотоницеского раствора, содержащего 0,11 И хлорида натрия и краситель катионный синий 0 вьонцентрации 27 г/и , при рН 7,2, Повторяют иетодику определения количествакрасителя, поглоценного клетками,г;писдн 1 ую в примере 1Предельная концентрация адсорбированного красителя составила 10 г/мЭЧисло отрицательных зарядов припредельной ддсорбции,оказалось равным2 ОТакии образом, отверждение эритроцитов не оказывает существенного влияия на число зарядов на поверхностиэритроцитов.П р и и е р . Эритроциты, выделенные из крови болього (7 Й года) сдхарль;л диабетом средней тяжести с гепанЬС Чго джМаКС Ц, Ъ 1 ф ИАЛмоксИиФ где И и- мокс Сравнение способов определения отрицательныхзарядов на поверхности клеток эритроцитов Предложенныйспособ Время определения заряда,чПроводимые операции 2-4 20-24 1. Выделение клеток 2, Отмывка от белков 3Инкубация с краси- телем 1. Выделение клеток 2. Отмывка3. Гемолиэ 5 16846гиепатией нижних конечностей, были соработаны согласно в примеру 1.Предел ь ная адсорбция составила4,7 г/м,Число отрицательных зарядов равно0,6 10.П р и и е р 6, Эритроциты, выделенные из крови больного (46 лет) сахарным диабетом средней тяжести, обрабатывали согласно примеру 1Предельная адсорбция красителяоказалась равной 12 г/и ,Число отрицательных зарядов равно1,4 1015П р и и е р 7, Эритроциты, выделенные из крови больного (22 года) сахарным диабетом тяжелой формы, были обработаны согласно примеру 1,Предельная адсорбция составила8.4 г/иЧисло отрицательных зарядов равно0,92 10Из приведенных выше примеров следует, что уменьшение числа отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов коррелируется с тяжестью заболевания сахарным диабетом,0 преимуществах предлагаемого спо"соба можно судить по данным, приведенным в таблице.Ошибка расчета по способу-прототипу составляет 20", по предлагаемомуспособу - 5 Ф.Полученные согласно предлагаемомуспособу данные могут быть использованы для выяснения механизма патологиии разработки способов лечения сахарного диабета,Формула изобретения 40" Способ определения отрицательныхзарядов на поверхности клеток эритроСравниваемые, Способ-прототиппризнаки 806цотов путем обработки эритроцитарно массы, отделения исследуемого раство". ра с последующим его спектрофотометрированием и расчетом числа отрица" . тельных зарядов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, эритроцитарную массу обрабатывают раствором катионного3 красителя с концентрацией 4-27 г/и при соотношении объемов 1:3, смесь инкубируют 2-3 ч при 18-22 С, в качестве исследуемого раствора используют центрифугат, получаемый при отделении эритроцитов, в котором определяют экстинкции при 590 нм, затем рассчитывают адсорбцию красителя по формуле гдеС - изменение равновесной концентрации в результате поглощения красителя;Ч - объем раствора красителя;И - молекулярная масса красите-лЯ 1И - объем клеток,а число отрицательных зарядов рассчитывают по Формуле число отрицательных зарядовна 1 эритроцит;постоянная;предельная адсорбция красителя;число эритроцитов в единицеобъема,1 ь 84680 Продолжение таблицы П 1)едложенныйспособ Сравниваемые, Способ-прототиппризнаки 4, фотометрирование Гидролиз5, Удаление липидов б, ХроматографированиеФотометрирование Используемаяаппаратура 1, Центрифуга 1, Центрифуга лабораборная2. Концентрационный фотоколориметр 2.Устройство дляэкстракции органическими растворителями3, Устройство дляионнообменной хроматографии Концентрационный фотоколориметр Составитель Л. АгуреевТехред Л,Сердокова Корректор.А. Обручар Редактор А, Иаковская Заказ 3502 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина,101