Способ выделения иммунодепрессора из тканей млекопитающих

.801243730 К 35/1 61 К 35/О ОР 1 Щ;11 Я ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Харьковский нательский институт мелогии 26 учно-исследовадицинской радио(72) С,М.Грин В.А.Бабичев, и И.Б.Жукова (53) 615.45 ( ерг, В,Г.Пухальская,.С.Толвинская 88,8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОДЕПРЕССОРА ИЗ ТКАНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ путем гомогенизации ткани с последующим центрифигурованием гомогената,солевым фракционированием супернатанта, хроматографией осадка и лиофилизацией целевого продукта, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа, перед фракционированием супернатант нагревают до,о65-80 С, осаждают ацетоном, а солевое фракционирование проводят при60-803.насыщения и хроматографию -на ионообменнике,Изобретение относится к фармацев-тической промьппленности и касаетсяполучения биологически активных веществ, обладающих фармакологическимдействием, 5Целью изобретения является упрощение способа получения иммунодепрессора из животного сырья.Способ осуществляют следующим образом,10Исходное сырье (печень, селезенка, тимус, сыворотка крови) гомогенизируют в Физиологическом растворе,цечтрифугируют и супернатант нагреваоют до 65-80 С для удаления термолабильных белков. Просветленный Фильтрованием раствор высапивают сульфатом аммония при 60-80% насыщения,преципитат растворяют в воде и обезвоживают ацетоном, Полученный на 20этом этапе порошок-сырец можно хранить продолжительное время при (+А) -) 5растворяют и очищают методом ионнообменной хроматографии.П р и м е р . 1 кг печени быкагомогенизируют в 2000 мл Физиологического раствора, центрифугируютпри 1000 е 15 мин при 4 С. ПолученныйО 30супернатант при перемешивании нагревают до 75 С, охлаждают до 10 С иденатурированнъе белки отделяютфильтрованием, К Фильтрату добавляютсульфат аммония до конечной концепт- З 5рации 50%-ного насыщения и выдержи-.вают на холоде 1 ч. Далее центрифугированием при 1000 п 20 мин удаляют образовавшийся осадок, а к супернатанту вновь добавляют сульфат аммо 40ния до 75%-ного насьпцения и оставляют на холоде 1 ч. Образовавшийсяпреципитат собирают центрифугированием, растворяют в 300 мл воды исмешивают с 10 объемами охлажденного до -15 С ацетойа, Через 1 ч образовавшийся прецигитат отделяют отрастворителя Фильтрованием под вакуумом, Осадок промывают на Фильтре в 500 мл охлажденного ацетона,Получают 1,8 г сухого порошка кремового цвета. Содержание белка (по Лоури) 86%, Методом электрофореза набумаге при стандартных условиях разделения белков сыворотки крови определяют состав образца. Препарат содержит,%: альбумин 42,7; альфаглобулии 8,5; альфа-глобулин 10,6; 14,8% бела-глобулин 14,8; гамма-глобулин 23,4,На втором этапе 300 мг препарата(порошка-сырца) растворяют в 20 мл0,01 М фосфатного буфера, рН 8,15.Полученный раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительноуравновешенной тем же буфером. Размер колонки 20 х 1,5 см. Колонку промыванл 0,2 М Фосфатным буфером,рН 815 затем 1 М раствором БаС 1 изатем активную фракцию элюируют0,1 н,ИаОН. Выход белков регистрируют на проточном денситометре.Активную Фракцию обессоливают наколонке с сефадексом Си при необходимости лиофильно высушивают.Испытание биологической активности препарата проводят методом локального гемолиза в геле на моделипервичного иммунного ответа животных, Для этого мьппам линии СВА вводят исследуемый препарат внутрибрюшиннс в Физиологическом растворе за сутки до иммунизации. В качестве антигена используют 5%-ную взвесь эритроцитов барана. Контрольная группа животных получает равный объем Физислоческого раствора. На 5-е сутки животных забивают, извлекают селезенки и готовят иэ них взвесь клеток.Взвесь клеток от каждой мыши помещают в отдельную пробирку и добавляют туда эритроциты барана до конечной концентрации 5% и 1%-ный раствор агара, приготовленного на солевом растворе Хэнкса и нагретого до048 С. Содержимое пробирки перемешивают и равномерно распределяют по поверхности чашки Петри, После застывания агаровой смеси чашки переносят в термастат на 1,5 ч. Далее в каждую чашку дооавляют по 2 мл комплемента морскои "винки, разведенного в 10 раз физиологическим раствором, и снова инкубируют в термостате 40 мин, Затем чашки извлекают и подсчитывают зоны лизиса на их поверхности. Первая эона лиэиса образуется одной антителообразующей клеткой (АОК). Общее. число антителообразующих клеток в селезенке каждой мьппи подсчитывается с учетом разведения клеточной взвеси, Например, селезенку мьппи гомогенизировали в 2 мл Физиологического раствора и в опыт взяли О,1 мл, т.е. 1/20 ч. Следова ельно, число1243730 4Результаты иммунодепрессивной активности образцов приведены в таблизон лизиса на чашке Петри необходимо умножить на 20. Полученные данныеобрабатывают статистически,це, Щфф Щ Исследуемый Дозаобразец Число ЧислоАОК ЯСК (МЛн) Серия Вес селезенки, 7к контролю 41500+ 108+7+2400 96+5,0 Контроль физиологичес,5 млкий раствор Опыт 1 "Сырец" 8000+ 103+8+1700 8719 го раствора П р и м е ч а н и е: ЯСК - число ядросодержащих клетокв селезенке, подсчитывается в каме-.ре Горяева. В предложенном способе сокращение временных и трудовых затрат обусловлено применением низкоскоростного центрифугирования, что позволяет использовать роторы с большим рабочим обЪемом и меньшим временем разгона и остановки, а также отсуствием длительного процесса диализа и возможностью накопления больших количеств Составитель Л.ШилинаРедактор М. Келемеш Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец Тираж 660 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открыткой 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д,4/5Заказ 3735/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная, 4Ф Опыт 2 Препаратпосле ионнообменной хрома- тографии раствора0,008 мгв 0,5 млфизиологическопромежуточного продукта-сырце, что в свою очередь позволяет применять хроматографические колонки большей емкостью и приводит к сокращению трудозатрат при очистке препарата, и докроме того, заменой гельфильтрации на ионнообменную хроматографию, обладающую большей емкостью и скоростью разделения.