Способ получения сорбента для аффинной хроматографии

(19) ЯТОМ" сЫ НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ О ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТАДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ путемобработки силохрома с привитымиаминопропильными группами модификатором - производным бензохинона,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью обесгечения селективностисорбента к менадионредуктазе, вкачестве модификатора используют4,5-диметокси,2-бензохинон. доваская СССР1980ССР ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ121746 1 2 Изобретение относится к энзимологии, аналитической биохимии, в частности к способу получения сорбентов для аффинной хроматографии менадионредуктазы.Цель изобретения - обеспечение селективности сорбента к менадионредуктазе.Способ получения модифицированно-, го пористого аминосилохрома, содержащего на поверхности группу н,со - о(сн)з мн 0 заключается в том, что силохром аминопропиловый подвергают взаимодействию с 4,5-диметокси,2-бензохиноном, взятом в избытке по отношению к аминогруппам носителя, в водно- органической среде при рН 7,2-7,5,Процесс получения сорбента, можно представить следующей схемой 20 25 30 35 Модифицированный 4-Б-метокси 1,2-бензохиноном пористый аминосило 1 ром несет ковалентно связанныйлиганд со структурой аминохинона,который является субстратом менадионредуктазы. Данный хинон специфически взаимодействует с менадионредуктазой с образованием ферментсубстратного комплекса, что обеспечивает высокую избирательную сорбцию Фермента из смеси белков,П р и м е р 1. Для синтеза сорбента используют силохром аминопропиловый (квалификация ч), которыйпредварительно просеивают через сита для получения однородных частицс диаметром О, 1-0,2 мм,40 45 5055 силохром + знс г 0- Фанинопропиооыйзн со 0силохроианинопоопилобый Я - 1 ОМзЧИ-ь д 0 45 г, аминосилохрома (617 мкмоль аминогрупп на 1 г) промывают 400 мп дистиллированной воды, 200 мл О, 1 М боратного буфера, рН 8,0; 200 мп О, 1 М ацетатного буфера, рН 4,0, на стеклянном Фильтре под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом. Промытый силохром переносят в колб, содержащую 600 мг 4,5-диметокси,2-бензохинона в О мм диметилсульфоксида и 30 мл 0,07 М фосфат - ного буфера, рН 7,3.Суспензию выдерживают при постоо янном перемешивании 60 ч при 22 С. Полученный продукт промывают от не- связавшегося бензохинона 100 мл раствора диметилсульфоксида, 300 мп О,1 М боратного буфера, рН 8,0;300 мп 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,0, 300 мл дистиллированной воды.П р и м е р 2. Препарат менадионредуктазы представляет собой белковую Фракцию гомогената из печени 15 крыс., содержащуюся в интервале 60807 насыщения сульфатом аммония с удельной активностью 4, 7 мкмоль/мин мгАктивность менадионредуктазы определяют по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии ИАДН при 600 нм.Сорбент, полученный по примеру 1, упаковывают в колонку высотой 2,5 см и диаметром 1,5 см и уравновешивают 0,07 М фосфатным буфером с рН ,5. На колонку наносят 2 мл исходного препарата менадионредуктазы, пропускают 30 мл 0,07 М фосфатного буфера, рН , г, с 0,5 М ИаС 7, После отмывки от несвязавшегося белка через колонку пропускают 25 мл 307 этиленгликоля в 0,07 М фосфатном буфере, рН7,5, содержащего 0,5 М ИаС 1. В элюате определяют активность менадион- .редуктазы. Удельная активность очищенного фермента составляет436 мкмоль/мин мг. Выход фермента 687, очистка менадионредуктазы в 93 раза.П р и м е р 3, Использование сорбента для аффинной хроматографии препарата менадионредуктазы, полученного из гомогената печени крыс после изоэлектрического осаждения примесных белков при рН 5,0,Исходный неочищенный препарат менадионредуктазы с удельной активностью 2,8 мкмоль/минмгчестве 5 мп наносят на колонку вы - сотой 8,7 см и диаметром 1,5 см, упакованную сорбентом, полученном но примеру 1, Остальные условия эксперимента по примеру 2, Удельная активность очищенной менадионредуктазы составляет 224 мкмоль/минмг. Выход фермента 607 со степенью очистки в 80 раз.Заказ 1029/10 Тираж 527 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 Предлагаемый способ позволяет в одну стадию получить афинный сорбент, йзбирательно связывающий менадионредуктазу и обеспечи. вающий ее выделение из смеси белков.